可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體Flt-1(sFlt-1)對動脈粥樣硬化斑塊的作用.pdf

1、目的：構(gòu)建攜帶可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體Flt-1（sFlt-1）目的基因的重組真核表達載體，將sFlt-1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC），觀察目的基因在內(nèi)皮細胞中的表達，并將sFlt-1重組質(zhì)粒導入動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)，觀察局部高表達的sFlt-1對動脈粥樣硬化斑塊的作用。 方法：1.攜帶sFlt-1cDNA的重組基因載體的構(gòu)建：從含有目的基因的質(zhì)?？寺∧０逯校妹盖械姆椒ǐ@得目的基因，酶切目的載體，純化酶切產(chǎn)物后

2、進行定向連接，轉(zhuǎn)化細菌感受態(tài)細胞，對長出的克隆進行PCR鑒定，陽性克隆證明目的基因已經(jīng)定向連入目的載體。再對PCR鑒定陽性的克隆進行測序和分析比對，比對正確的即為構(gòu)建成功的融合蛋白表達質(zhì)粒載體。2.HUVEC的培養(yǎng)以及western blotting檢測sFlt-1基因在HUVEC中的表達：pEGFP-N1-sFlt-1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的HUVEC，通過熒光及western blotting檢測sFlt-1基因在體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞的

3、表達。3.sFlt-1基因?qū)用}粥樣硬化斑塊的影響：雄性新西蘭大白兔48只，隨機分為4組。①正常對照組（n=8）。②假手術(shù)組（n=8）。③球囊損傷+高脂飲食+pEGFP-N1組（n=16）。④球囊損傷+高脂飲食+pEGFP-N1-sFlt-1組（n=16）。一、二兩組給予正常顆粒飼料飲食，三、四兩組給予高脂飲食，兩周后第二組行假手術(shù)，三、四兩組均行髂動脈球囊損傷血管內(nèi)皮，其中第三組在球囊損傷后導入空質(zhì)粒pEGFP-N1，第四組球囊損傷后

4、導入目的基因sFlt-1，3天后western blotting檢測局部sFlt-1基因的表達。實驗開始及實驗結(jié)束時分別檢測高脂血癥的形成情況。3個月后取靶血管行HE染色對斑塊進行形態(tài)學測量，CD34免疫組化陽性細胞數(shù)檢測觀察新生血管形成情況。 結(jié)果：1.成功構(gòu)建攜帶sFlt-1基因的重組質(zhì)粒pEGFP-N1-sFlt-1，2.sFlt-1基因轉(zhuǎn)染HUVEC后有效表達，3.成功制備兔髂動脈粥樣硬化斑塊模型，4.sFlt-1基因有