人BRCA1真核表達載體的構(gòu)建及表達.pdf

1、研究背景:乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一,隨著生活水平的提高,近年來發(fā)病率也呈上升趨勢。在某些地區(qū),乳腺癌躍居女性惡性腫瘤死亡的首位。研究表明,乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是多基因多因素共同作用的結(jié)果,且有家族遺傳傾向。在乳腺癌高發(fā)家族中,存在一個或多個常染色體顯性乳腺癌易感基因,其中最常見的是乳腺癌易感基因BRCA1(Breast cancer susceptibility gene1)和BRCA2(Breastcancer susceptibi

2、lity gene2)。相關(guān)研究表明,BRCA1不僅能夠抑制細胞生長,還參與細胞周期和基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、DNA損傷修復(fù)以及細胞凋亡等多種重要細胞活動,在維持基因組穩(wěn)定性中起重要作用。全球范圍有遺傳性乳腺癌和卵巢癌家族史的人群中BRCA1突變率為12.80％,但是分析130名中國女性乳腺癌BRCA1突變率為3.8％。80％以上的遺傳性乳腺癌和部分散發(fā)乳腺癌的發(fā)病與BRCA1基因結(jié)構(gòu)及功能異常有密切關(guān)系。大約有40-50％的遺傳性乳腺癌是由B

3、RCA1突變引起的。探討B(tài)RCA1的作用機制,為乳腺癌的早期診斷、臨床治療提供新的靶點。
　　目的:構(gòu)建人BRCA1基因真核表達載體,篩選出高表達BRCA1基因的乳腺癌細胞株MDA-MB-231,為觀察高表達BRCA1蛋白的乳腺癌細胞株的生物學(xué)特性及細胞周期變化奠定基礎(chǔ)。
　　方法:從胎盤中提取總RNA,RT-PCR方法擴增cDNA序列,擴增后產(chǎn)物與pMD18-T載體連接,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,挑克隆,提取質(zhì)粒,XhoⅠ

4、和BamHⅠ雙酶切鑒定,選擇正確的克隆質(zhì)粒,用XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切后,膠回收酶切片段;真核表達載體pcDNA3.1(+),經(jīng)雙酶切后,膠回收線性載體片段,上述兩者共同的膠回收片段與T4DNA連接酶連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-BRCA1,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒重組質(zhì)粒pcDNA3.1-BRCA1,轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞株MDA-MB-231。以G418篩選從而獲得穩(wěn)定的、高表達BRCA1的細胞株MDA-M

5、B-231。提取轉(zhuǎn)染前后細胞總蛋白,Western blot方法鑒定BRCA1的表達。
　　結(jié)果:從人胎盤組織中成功克隆出BRCA1基因N端933個堿基。測序及提取質(zhì)粒酶切鑒定證實pcDNA3.1-BRCA1中含有插入方向、片斷大小和DNA序列均正確的BRCA1基因N端933個堿基序列。轉(zhuǎn)染后較轉(zhuǎn)染前的乳腺癌細胞株中BRCA1表達水平增高。應(yīng)用SPSS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理(P<0.01)。
　　結(jié)論:1.成功克隆人乳腺癌B