斑馬魚順鉑耳毒性模型及損傷后毛細(xì)胞再生的研究.pdf

1、斑馬魚(zebrafish)作為新興脊柱模式生物，具有個(gè)體小、養(yǎng)殖簡易、體外受精、體外發(fā)育、生殖周期短、繁殖能力強(qiáng)、胚胎透明、品系繁多等特點(diǎn)，且基因與人類基因約87％相似。斑馬魚雖無外耳和中耳，但具脊椎動(dòng)物之典型內(nèi)耳結(jié)構(gòu)。除內(nèi)耳外，斑馬魚還具有另一感覺神經(jīng)器官——側(cè)線，其由大量單個(gè)神經(jīng)丘組成，每個(gè)神經(jīng)丘包含一簇感覺毛細(xì)胞。尤為重要的是，斑馬魚毛細(xì)胞在損傷后具有強(qiáng)大再生能力。有鑒于此，國際上有研究者利用斑馬魚側(cè)線系統(tǒng)研究毛細(xì)胞發(fā)育、損傷及

2、再生;部分研究者亦采用成年斑馬魚研究內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷及再生。
　　順鉑為臨床常用的抗腫瘤藥物，在治療腫瘤的同時(shí)也伴有不同程度副作用，損傷人類內(nèi)耳毛細(xì)胞并導(dǎo)致永久性感音神經(jīng)性聽力損失為其嚴(yán)重副作用之一，但其損傷機(jī)制仍未完全明確。既往研究認(rèn)為哺乳動(dòng)物內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷是不可逆的，而鳥類、魚類及兩棲類等低等脊柱生物，其毛細(xì)胞損傷后卻存在不同程度再生。近年有研究表明，哺乳動(dòng)物前庭及內(nèi)耳新生毛細(xì)胞也具微弱的再生潛能，這為人類聽覺毛細(xì)胞再生點(diǎn)燃希望

3、。因此，加強(qiáng)內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷、再生機(jī)制以及相關(guān)基因治療研究顯得尤為重要。
　　既往研究中，已有順鉑損傷哺乳動(dòng)物、鳥類內(nèi)耳毛細(xì)胞的研究報(bào)告，但尚無順鉑損傷成年魚類內(nèi)耳毛細(xì)胞的文獻(xiàn)報(bào)告，本研究通過建立成年斑馬魚順鉑耳毒性模型將彌補(bǔ)國內(nèi)外相關(guān)研究領(lǐng)域的空白，有助進(jìn)一步揭示順鉑損傷機(jī)制。亦有研究表明順鉑損傷離體培育的小雞毛細(xì)胞后并不存在損傷后毛細(xì)胞再生，鑒于斑馬魚模型的優(yōu)勢及其毛細(xì)胞強(qiáng)大自發(fā)再生能力，本實(shí)驗(yàn)以成年及幼體斑馬魚為對象研究順鉑耳

4、毒性損傷，探討順鉑損傷對毛細(xì)胞再生的影響，揭示順鉑損傷后成年及幼體斑馬魚毛細(xì)胞再生的異同，也為今后斑馬魚毛細(xì)胞再生相關(guān)基因研究打下一定基礎(chǔ)。
　　目的：
　　于國內(nèi)、外首次建立成年斑馬魚順鉑耳毒性損傷模型，彌補(bǔ)相關(guān)研究領(lǐng)域的空白;探討順鉑對成年斑馬魚內(nèi)耳及幼體斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞的毒性損傷和順鉑損傷對毛細(xì)胞再生的影響，為揭示調(diào)控毛細(xì)胞再生相關(guān)基因打下基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.順鉑損傷成年斑馬魚內(nèi)耳毛細(xì)胞及損傷后毛細(xì)

5、胞增殖檢測
　　1.1 成年斑馬魚腹腔注射給藥
　　取發(fā)育4～5月齡成年斑馬魚，雌雄隨機(jī)，重量介于0.38～0.55g之間。隨機(jī)分為順鉑組、慶大霉素組及生理鹽水對照組，每組6條。順鉑組給予連續(xù)兩次注射24mg/kg順鉑溶液，間隔12h;慶大霉素組首次注射與順鉑組等量生理鹽水，12h后注射250mg/kg硫酸慶大霉素溶液;對照組連續(xù)兩次注射與順鉑組等量生理鹽水。
　　1.2 成年斑馬魚內(nèi)耳毛細(xì)胞靜纖毛染色
　　末次

6、腹腔注射后第1d、10d，麻醉并處死部分順鉑組及對照組斑馬魚。斷頭后置于4％多聚甲醛中，4℃下固定過夜，PBS清洗，體視顯微鏡下解剖并分離內(nèi)耳各結(jié)構(gòu)（球囊斑、聽壺斑及橢圓囊斑）。解剖后的內(nèi)耳組織于1∶100 FITC-鬼筆環(huán)肽中避光染色1h，PBS清洗，鋪片，熒光顯微鏡下觀察、拍照。
　　1.3 成年斑馬魚內(nèi)耳毛細(xì)胞增殖染色
　　末次腹腔注射后24h、48h、72h，各組均經(jīng)腹腔注射15μl(5mg/ml) Brdu，恢復(fù)1

7、0h，麻醉、斷頭處死斑馬魚，解剖固定如上訴。分別取解剖后內(nèi)耳組織在4℃下于濃度為1:100鼠單克隆抗Brdu抗體培育過夜，PBS漂洗，1∶200兔抗鼠Alexa Fluor488共軛二抗室溫下處理1h，PBS漂洗，鋪片，滴Dapi染液，蓋片，熒光顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)Brdu陽性細(xì)胞。
　　2.順鉑損傷幼體斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞及地塞米松促側(cè)線毛細(xì)胞增生的探討取受精后5天(5dpf)斑馬魚幼魚，隨機(jī)分組，每組10-15條不等;神經(jīng)丘毛細(xì)胞染

8、色選擇2μM熒光活性染液Yo-Pro-1;選擇P1、P7、P8三個(gè)固定側(cè)線神經(jīng)丘行毛細(xì)胞計(jì)數(shù)。
　　2.1 順鉑損傷幼體斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞
　　5dpf斑馬魚幼魚于2μM Yo-Pro-1染色30分鐘，隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組加入1nM順鉑溶液，對照組加入等量系統(tǒng)水，暗室內(nèi)培育3h、6h。撤藥后0h、3h、6h于熒光顯微鏡下觀察拍照并計(jì)數(shù)神經(jīng)丘內(nèi)毛細(xì)胞。
　　2.2 地塞米松促進(jìn)幼體斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞增生
　　

9、取5dpf斑馬魚幼魚隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組加入濃度為10μM、25μM地塞米松溶液，對照組加入等量系統(tǒng)水，培育48h，撤藥即刻行Yo-Pro-1染色，熒光顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)神經(jīng)丘內(nèi)毛細(xì)胞。
　　3.3地塞米松對順鉑、新霉素?fù)p傷后側(cè)線毛細(xì)胞再生的影響
　　取5dpf斑馬魚幼魚，隨機(jī)分為對照組、順鉑組、新霉素組。順鉑組加入1nM順鉑溶液處理3h，新霉素組加入200μM硫酸新霉素溶液處理1h，兩組在撤藥后3h均加入25μM

10、地塞米松溶液或等量系統(tǒng)水，對照組加入等量系統(tǒng)水。于地塞米松作用后24h、48h分別行Yo-Pro-1染色，熒光顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)神經(jīng)丘內(nèi)毛細(xì)胞。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　資料分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多重比較采用單向方差分析(one-way ANOVA)，方差齊性檢驗(yàn)采取Levene檢驗(yàn)。設(shè)P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　

11、　1.順鉑注射對成年斑馬魚內(nèi)耳毛細(xì)胞束密度的影響
　　通過FITC-鬼筆環(huán)肽染色，發(fā)現(xiàn)斑馬魚聽覺感覺上皮球囊、橢圓囊、聽壺具有各自不同的形態(tài);在末次順鉑注射后第1天，選取球囊斑喙端至尾端軸線上面積為1600μm2的四個(gè)固定區(qū)域(5％，25％，50％，75％)行毛細(xì)胞束計(jì)數(shù)，得出四個(gè)區(qū)域毛細(xì)胞束均數(shù)分別為:36.25±2.82、19.75±2.12、16.50±1.93、19.62±2.33(N=7-9)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)同一部位順鉑組毛細(xì)胞

12、束均少于對照組（P＜0.05）。在末次順鉑注射后第10天，計(jì)數(shù)得出球囊斑四個(gè)區(qū)域的毛細(xì)胞束均數(shù)分別為:38.83±2.32、25.14±2.41、19.86±1.77,26.71±2.50(N=6-7)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)25％區(qū)域毛細(xì)胞束少于對照組（P＜0.05），其余各區(qū)域毛細(xì)胞束與對照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.順鉑損傷后成年斑馬魚內(nèi)耳毛細(xì)胞的增殖檢測
　　通過Brdu染色發(fā)現(xiàn)正常成年斑馬魚內(nèi)耳感覺上皮內(nèi)存

13、在零散的增殖細(xì)胞。選取球囊斑行增殖細(xì)胞計(jì)數(shù)，得出在連續(xù)腹腔注射24mg/kg順鉑溶液后24h、48h，每塊球囊斑內(nèi)增殖細(xì)胞數(shù)分別為:7.29±1.50、10.71±2.21(N=7)，明顯少于對照組（P＜0.05）及慶大霉素組（P＜0.001），而連續(xù)順鉑注射后72h，每塊球囊斑內(nèi)增殖細(xì)胞數(shù)為:25.71±3.45(N=7)，明顯多于同期對照組（P＜0.001）;在硫酸慶大霉素注射后24h、48h、72h均可檢測到大量增殖細(xì)胞，但隨著時(shí)

14、間的推移增殖細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，經(jīng)統(tǒng)計(jì)三個(gè)時(shí)間段球囊斑內(nèi)增殖細(xì)胞數(shù)均多于同期生理鹽水對照組(P＜0.005)。
　　3.順鉑損傷幼體斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞
　　1nM順鉑處理6h組在撤藥后0h、3h計(jì)數(shù)P1、P7、P8三個(gè)神經(jīng)丘得出毛細(xì)胞均數(shù)為:1.970±0.526(N=11)，1.767±0.629(N=10);而1nM順鉑處理3h組在撤藥后0h、3h、6h計(jì)數(shù)得到毛細(xì)胞均數(shù)為:5.909±0.761(N=11)，2.633±0

15、.483(N=10)，2.528±0.643(N=12)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)各順鉑處理組的側(cè)線毛細(xì)胞數(shù)量均少于正常對照組（P＜0.05）。
　　4.地塞米松促進(jìn)正常幼體斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞的增生
　　10μM、25μM地塞米松溶液處理5dpf斑馬魚48h，在撤藥后計(jì)數(shù)毛細(xì)胞的數(shù)量分別為:11.028±1.314(N=12)，11.364±1.545(N=11);同一部位7dpf對照組毛細(xì)胞計(jì)數(shù)為:9.922±0.862(N=13)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)1

16、0μM、25μM地塞米松組與7dpf對照組相比神經(jīng)丘毛細(xì)胞數(shù)量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　5.地塞米松促進(jìn)新霉素而非順鉑損傷后幼體斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞的增生
　　通過計(jì)數(shù)側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞，經(jīng)單向方差分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果:新霉素+地塞米松24h組vs新霉素24h組，P=0.178，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;新霉素+地塞米松48h組vs新霉素48h組，P=0.001，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在25μM地塞米松處理后24h、48h，順

17、鉑+地塞米松組與損傷對照組相比，兩組毛細(xì)胞數(shù)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.經(jīng)腹腔連續(xù)兩次注射24mg/kg順鉑溶液（間隔12小時(shí)）可損傷成年斑馬魚內(nèi)耳毛細(xì)胞;正常情況下，成年斑馬魚內(nèi)耳毛細(xì)胞存在自發(fā)更新現(xiàn)象;在耳毒性藥物慶大霉素?fù)p傷后可迅速啟動(dòng)毛細(xì)胞再生，相對于慶大霉素?fù)p傷，順鉑損傷可延緩成年斑馬魚內(nèi)耳毛細(xì)胞的再生進(jìn)程。
　　2.1 nM順鉑浸泡給藥可快速損傷幼體斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞，且順鉑損傷存在