基于斑馬魚毛細(xì)胞損傷模型的抗耳毒活性組分的研究.pdf

1、聽力功能障礙是由于各種原因引起雙耳不同程度損傷而達(dá)不到正常功能水平的感覺功能障礙。若其不能被及時(shí)發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行良好的干預(yù)將嚴(yán)重影響患者的言語、認(rèn)知及情感的發(fā)育，進(jìn)而影響其身心健康和生活質(zhì)量，同時(shí)也會(huì)加重社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
　　氨基糖苷類抗生素是用于靶向革蘭陰性菌的一類重要的抗感染劑，作為一類廣譜抗菌且無明顯過敏性的抗生素在臨床一直備受青睞，但其應(yīng)用卻因巨大的耳毒性和腎毒性而受到很大限制。即便如此，在治療多耐藥性菌群感染時(shí)，慶大霉素等氨基糖

2、苷類抗生素發(fā)揮著極其重要的作用。由于其價(jià)廉易得、抗菌譜廣等特點(diǎn)，臨床應(yīng)用也相對(duì)廣泛，引發(fā)的聽力障礙在治療人群占有較高的比例。同時(shí)，臨床上尚無療效良好的治療耳聾藥物。因此，建立一種藥源性耳聾模型，進(jìn)一步尋找抗耳聾藥物達(dá)到克服其毒性而不影響其藥效的方法，并進(jìn)一步闡明耳聾機(jī)制和藥物抗耳聾機(jī)制顯得尤為重要。以往比較常見的藥物耳毒性評(píng)級(jí)機(jī)制是建立在藥物對(duì)豚鼠或者大鼠的內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷基礎(chǔ)之上的。由于這兩種模式動(dòng)物在對(duì)藥物的毒性安全進(jìn)行考察時(shí)會(huì)存在較

3、大局限性，斑馬魚作為新型模式動(dòng)物也逐漸吸引了越來越多的科研工作者。
　　許多傳統(tǒng)中藥及相關(guān)方劑被證明對(duì)耳聾具有一定的療效，而對(duì)具體到某一種中藥的抗耳聾活性組分卻是知之甚少。此外，藥用植物內(nèi)生真菌素以代謝產(chǎn)物豐富、活性多樣化而成為近年天然藥物研究的熱點(diǎn)之一，但其用于抗耳毒性活性成分篩選的研究甚少。因此，本研究以慶大霉素為模型藥物，旨在建立一種穩(wěn)定的藥源性斑馬魚毛細(xì)胞損傷模型，通過對(duì)多種中藥材粗提物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇三相萃取物

4、和水相，以及從兩株華南毛蕨內(nèi)生真菌CYC6和CYC18發(fā)酵液中分離純化的部分次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行篩選，快速尋找具有抗耳毒活性組分。主要研究?jī)?nèi)容包括：
　　（1）利用已知具有明確耳毒性的慶大霉素建立藥源性斑馬魚毛細(xì)胞損傷模型，并將一側(cè)斑馬魚神經(jīng)丘（SO1、SO2、O1、OC1）毛細(xì)胞形態(tài)及其數(shù)量的變化作為檢測(cè)指標(biāo)。將斑馬魚分別置于100、50、25及10μmol/L慶大霉素溶液中孵育8、6和4 h發(fā)現(xiàn)，10μmol/L慶大霉素中孵育6

5、h可以使毛細(xì)胞損傷程度達(dá)到一半，建立達(dá)到類似IC50效果的毛細(xì)胞損傷模型。同時(shí)通過不同濃度（0.5％、0.2%）DMSO作用不同時(shí)間（6、4及2h）發(fā)現(xiàn)，DMSO對(duì)斑馬魚具有一定的損傷作用；0.2%DMSO對(duì)斑馬魚毛細(xì)胞損傷很小，可作為合適的藥物助溶劑。
　?。?）利用所建立的模型，首次將具有抗耳毒性的N-乙酰半胱氨酸（NAC）和依達(dá)拉奉單獨(dú)作為陽性藥物，揭示出該藥源性斑馬魚毛細(xì)胞損傷模型的穩(wěn)定性，以及后期用于大規(guī)模篩選時(shí)的可行性

6、。研究發(fā)現(xiàn)，200μmol/L NAC對(duì)慶大霉素介導(dǎo)的斑馬魚毛細(xì)胞損傷具有拮抗作用；250μmol/L依達(dá)拉奉也對(duì)其具有保護(hù)作用。
　　（3）多種中藥提取物中抗耳毒活性組分的篩選。利用已建立的斑馬魚毛細(xì)胞損傷模型研究不同濃度（20、100和500μg/mL）香附、蟬蛻、地龍、苦杏仁、郁金、薄荷、紅花、菊花、黃芩、黃芪、梔子及白芍這12味中藥萃取物（石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相），篩選出了具有抗耳毒性的活性組分，包括香附乙酸