斑馬魚心臟毒性評價模型的建立及美托洛爾心臟毒性作用機制研究.pdf

1、藥物從設(shè)計到上市的整個研究階段,毒性反應(yīng)是導(dǎo)致藥物研發(fā)失敗的最主要原因。即使上市后仍有許多藥物由于出現(xiàn)研發(fā)階段未能發(fā)現(xiàn)的毒性反應(yīng)而被撤市或嚴(yán)格限制使用。藥物的心血管毒性占藥物全部毒性反應(yīng)的26％。伴隨著組合化學(xué)、基因組學(xué)等學(xué)科的迅猛發(fā)展,每年新增大量的化合物進入新藥研發(fā)領(lǐng)域,必然要求在臨床前研究階段對其心血管毒性進行靈敏、快速、準(zhǔn)確及實用的高通量篩選與評價,及早發(fā)現(xiàn)心血管毒性,提高新藥研發(fā)的成功率。目前,用于藥物毒性評價的模型有兩大類:

2、一類是以細(xì)胞、組織為代表的體外評價模型,雖適合高通量毒性篩選,但不能反映動物的新陳代謝和整體生理過程。另一類是以嚙齒類為代表的哺乳動物體內(nèi)評價模型,可從整體水平直觀地反映藥物的毒性作用,但不適合新藥研發(fā)早期藥物毒性的高通量篩選。由于以上兩類方法具有各自的局限性,越來越多的研究人員使用斑馬魚進行藥物毒性的篩選和安全性評價。斑馬魚是一種脊椎模式動物,具有個體小、產(chǎn)卵多、體外受精與發(fā)育、發(fā)育快、胚胎透明、易于觀察、飼養(yǎng)簡便等優(yōu)點。斑馬魚在生理

3、過程、毒性反應(yīng)方面和人類非常相似。目前,斑馬魚已被歐洲替代法驗證中心(ECVAM)推薦為新的替代動物,成為僅次于小鼠的第二優(yōu)先脊椎模式動物。
　　美托洛爾屬于第二代選擇性β1受體阻斷劑,臨床廣泛用于治療高血壓、心律失常、心力衰竭等心血管疾病。同時,美托洛爾也具有引起心力衰竭加重、心率過緩等心血管毒性反應(yīng)。
　　本研究依據(jù)斑馬魚的生理結(jié)構(gòu)優(yōu)勢,以其為模式動物,從心血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能兩方面對已知心血管毒性陽性化合物進行安全性評價

4、,探討斑馬魚模型被用于藥物心血管毒性篩選和安全性評價的可靠性。并將斑馬魚心血管毒性評價模型用于美托洛爾心血管毒性機制研究。
　　本研究選擇斑馬魚胚胎為試驗動物,以已知心臟毒性陽性藥物阿霉素、布洛芬、5-氟脲嘧啶、利多卡因為受試藥物,通過對斑馬魚心血管系統(tǒng)形態(tài)學(xué)觀察、靜脈竇-動脈球(SV-BA)距離測量、心率測量評價四種藥物的心臟毒性作用特征,對斑馬魚心血管毒性評價模型的有效性進行驗證。實驗結(jié)果表明,4種心血管毒性陽性藥物作用48h

5、后,斑馬魚心血管系統(tǒng)出現(xiàn)不同程度的心包水腫、卵黃囊水腫、出血等形態(tài)學(xué)改變;斑馬魚心臟發(fā)育過程受到影響,造成心臟環(huán)化不全,SV-BA距離延長;斑馬魚心臟功能受損,出現(xiàn)心率降低,隨著濃度增加心率逐漸降低,呈現(xiàn)明顯劑量反應(yīng)關(guān)系。
　　美托洛爾作用24h,可引起斑馬魚胚胎死亡。各實驗組斑馬魚胚胎死亡數(shù)目隨著美托洛爾濃度升高而不斷增加,具有明顯劑量依賴性。經(jīng)計算美托洛爾24hLC50為8.1g/L,95%可信區(qū)間為6.7～9.7g/L。本研

6、究對美托洛爾的心臟毒性作用機制進行了初步探索。以6hpf斑馬魚胚胎為模型,以斑馬魚心血管系統(tǒng)形態(tài)學(xué)改變、SV-BA間距和心率為毒性終點,通過顯微鏡下形態(tài)觀察、測量SV-BA距離和DVC攝像系統(tǒng)測量心率,評價美托洛爾的心血管毒性效應(yīng)特征。實驗結(jié)果顯示,美托洛爾引起斑馬魚心包水腫、卵黃囊水腫、出血等心血管系統(tǒng)形態(tài)學(xué)改變;影響斑馬魚心臟發(fā)育,破壞環(huán)化過程,致使心室和心房空間位置改變,導(dǎo)致SV-BA距離延長,心臟出現(xiàn)線性化。美托洛爾還損害斑馬魚

7、心臟正常生理功能,造成心率降低。通過組織切片和HE染色方法研究美托洛爾暴露后斑馬魚心臟縮小是否由于心臟心肌組織減少所造成。本實驗結(jié)果證實,斑馬魚心肌細(xì)胞和心肌層減少是導(dǎo)致斑馬魚心臟縮小的主要原因。文獻報道心肌細(xì)胞凋亡是進行性心力衰竭的主要原因。為了研究美托洛爾是否引起斑馬魚心肌細(xì)胞凋亡,本研究運用吖啶橙熒光活體染料對斑馬魚心肌細(xì)胞凋亡進行初步檢測。熒光顯微鏡下,美托洛爾處理組斑馬魚心臟出現(xiàn)致密亮點,提示美托洛爾可誘導(dǎo)斑馬魚心肌細(xì)胞凋亡。

8、為進一步研究心肌細(xì)胞凋亡,使用TUNEL法對斑馬魚心肌凋亡細(xì)胞進行量化評價。實驗結(jié)果顯示,美托洛爾處理組心肌細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組。充分說明美托洛爾可誘導(dǎo)斑馬魚心肌細(xì)胞凋亡。文獻揭示β腎上腺素能受體阻斷劑可通過阻斷β1腎上腺素能受體抑制心肌細(xì)胞凋亡,而通過阻斷β2腎上腺素能受體促進心肌細(xì)胞凋亡。為深入研究美托洛爾誘導(dǎo)斑馬心肌細(xì)胞凋亡的機制,本研究提取斑馬魚胚胎總RNA,進行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增。電泳結(jié)果顯示,斑馬魚同時具有β1和β2腎上

9、腺素能受體。Bcl-2家族基因在細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)中起著非常重要的作用。斑馬魚Bcl-2基因家族、caspase基因家族和人相應(yīng)基因具有高度同源性。應(yīng)用半定量PCR方法檢測斑馬魚中凋亡調(diào)節(jié)因子zfBcl-2、zfBax-a和zfcaspase-3、zfcaspase-9基因表達(dá)的情況。實驗結(jié)果表明,美托洛爾誘導(dǎo)斑馬魚zfBcl-2基因表達(dá)水平上調(diào),同時上調(diào)zfBax-a基因表達(dá),但是zfBax-a基因比zfBcl-2基因的表達(dá)量高。因此,z

10、fBcl-2/zfBax-a比值逐漸下降。說明美托洛爾誘導(dǎo)斑馬魚心肌細(xì)胞凋亡是通過調(diào)節(jié)zfBcl-2家族基因表達(dá)啟動細(xì)胞凋亡信號。Caspase酶系作為細(xì)胞凋亡的中樞效應(yīng)器,在細(xì)胞凋亡的啟動和過程中發(fā)揮著極為重要的作用。半定量PCR結(jié)果顯示,美托洛爾可引起斑馬魚zfcaspase-3和zfcaspase-9基因的表達(dá)水平升高。蛋白印跡試驗進一步證實美托洛爾可上調(diào)斑馬魚細(xì)胞凋亡蛋白酶zfcaspase-3表達(dá)。上述實驗結(jié)果充分表明美托洛爾

11、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與caspase級聯(lián)激活密切相關(guān)。
　　本研究成功建立了藥物心血管毒性高通量篩選和安全性評價斑馬魚模型。通過斑馬魚模型研究美托洛爾對心血管系統(tǒng)的毒性作用,探討了其可能機制。結(jié)果表明,美托洛爾引起心臟毒性的作用機制是通過影響zfBcl-2和zfBax-a的表達(dá)啟動細(xì)胞凋亡程序,通過caspase級聯(lián)激活誘導(dǎo)斑馬魚心肌細(xì)胞凋亡,這可能是通過阻斷β2受體實現(xiàn)的。本研究的結(jié)果為深入研究β受體阻斷劑心血管毒性作用機制和新藥研制提