濾泡輔助性T細(xì)胞與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的相關(guān)性研究.pdf

1、背景:系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種以多種自身抗體生成和器官損害為特征的自身免疫性疾病。一般認(rèn)為SLE的發(fā)生與 T、B淋巴細(xì)胞的高度活化、免疫球蛋白增多等機(jī)體異常免疫反應(yīng)有關(guān),其中以B細(xì)胞增殖分化和功能異常最為突出。
　　在T、B淋巴細(xì)胞的相互作用中,人們一直認(rèn)為Th1、Th2細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ、IL-4在輔助B細(xì)胞分泌抗體過程中起重要作用。但是越來越多的證據(jù)表明,濾泡輔

2、助性T細(xì)胞(T follicular helper,Tfh)是主要的輔助B細(xì)胞的T細(xì)胞亞群,Tfh細(xì)胞在自身免疫病中的作用受到越來越多的重視,正成為新的研究熱點(diǎn)。
　　鑒于SLE患者體內(nèi)可能出現(xiàn)異位Tfh細(xì)胞并參與SLE的發(fā)病,以及Bcl-6、miRNA對Tfh細(xì)胞分化的調(diào)控作用。本研究檢測SLE患者和健康對照組淋巴結(jié)及外周血中具有Tfh表型的細(xì)胞群變化,分析這些細(xì)胞群與Tfh細(xì)胞功能的關(guān)聯(lián),探討Tfh細(xì)胞在SLE發(fā)病中的作用;同

3、時(shí)以Bcl-6為切入點(diǎn),利用生物信息學(xué)方法篩選出調(diào)控Bcl-6表達(dá)的miRNAs,檢測Bcl-6、miRNAs表達(dá)水平,分析其變化對Tfh細(xì)胞分化的影響,初步探討Tfh細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制。
　　目的:1.了解Tfh細(xì)胞在SLE患者淋巴結(jié)和外周血中的變化及其在SLE發(fā)病中的作用。
　　2.探討B(tài)cl-6及相關(guān)miRNA對SLE患者外周血中Tfh細(xì)胞分化的影響。
　　方法:1.選擇初發(fā)SLE患者、健康志愿者各8例,用免疫組

4、化雙染法檢測SLE及正常對照淋巴組織中Tfh樣細(xì)胞(CD4+Bcl6+),分析淋巴組織中CD4+Bcl6+細(xì)胞的變化與SLE發(fā)病的關(guān)聯(lián)。
　　2.選取活動(dòng)SLE患者47例、穩(wěn)定SLE患者48例和健康志愿者59例,用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血PBMC中Tfh樣細(xì)胞(CD4+CXCR5+ICOS+、CD4+CXCR5+、CD4+ICOS+)百分比,分析其變化與SLE發(fā)病及臟器損害的關(guān)系。
　　3.選取上述部分樣本,用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD

5、19+B細(xì)胞,用ELISA法檢測血清IL-21、CXCL13,收集SLE患者各種實(shí)驗(yàn)室資料,根據(jù)Tfh樣細(xì)胞與CD19+B細(xì)胞、IL-21、CXCL13以及自身抗體水平的關(guān)聯(lián),分析 CD4+CXCR5+ICOS+、CD4+CXCR5+、CD4+ICOS+細(xì)胞群是否具有Tfh細(xì)胞的功能。
　　4.以Bcl-6為靶基因,采用生物信息學(xué)方法篩選調(diào)控Bcl-6表達(dá)的miRNAs;從上述樣本中選擇8例初發(fā)SLE患者和7例健康志愿者,用實(shí)時(shí)熒

6、光定量PCR檢測外周血PBMC中Bcl-6 mRNA和篩選出的miRNAs的表達(dá)水平,比較SLE患者和健康志愿者的Bcl-6 mRNA、miRNAs表達(dá)水平的差異,對表達(dá)存在差異的miRNAs,擴(kuò)大樣本至19例初發(fā)SLE患者和13例健康志愿者,分析miRNAs與Bcl-6 mRNA表達(dá)的關(guān)聯(lián)及對外周血中CD4+CXCR5+ICOS+、CD4+CXCR5+、CD4+ICOS+細(xì)胞分化的影響。
　　結(jié)果:1.淋巴結(jié)中Tfh樣細(xì)胞的變化

7、:SLE患者組較對照組的淋巴結(jié)中CD4+Bcl6+細(xì)胞增多,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.058)。
　　2.外周血中Tfh樣細(xì)胞的變化:比較活動(dòng)SLE組、穩(wěn)定SLE組和正常對照三組間外周血中的CD4+CXCR5+、CD4+ICOS+及CD4+CXCR5+ICOS+細(xì)胞群百分比變化,結(jié)果顯示CD4+ICOS+、CD4+CXCR5+ICOS+細(xì)胞群百分比變化在三組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=49.635,P＜0.001;χ2=32.15

8、0,P＜0.001), CD4+CXCR5+細(xì)胞群百分比變化在三組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.421,P=0.110)。采用Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)兩兩比較發(fā)現(xiàn),活動(dòng)SLE組較穩(wěn)定SLE組、活動(dòng)SLE組較正常對照組、穩(wěn)定SLE組較正常對照組間CD4+ICOS+細(xì)胞群百分比均顯著升高(P＜0.001);活動(dòng)SLE組較穩(wěn)定SLE組、正常對照組間的CD4+CXCR5+ICOS+細(xì)胞百分比均顯著升高(P＜0.001),穩(wěn)定SLE

9、組和正常對照組間CD4+CXCR5+ICOS+細(xì)胞群百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.090)。
　　3.外周血中Tfh樣細(xì)胞變化與SLE臟器損害的關(guān)聯(lián):根據(jù)不同臨床特點(diǎn),比較PBMC中CD4+CXCR5+ICOS+、CD4+CXCR5+、CD4+ICOS+細(xì)胞的百分比變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有皮疹的SLE患者較無皮疹者CD4+CXCR5+細(xì)胞群百分比顯著降低(P=0.021)。對有皮疹SLE組、無皮疹組和正常對照三組間多重比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn) C

10、D4+CXCR5+細(xì)胞群百分比在三組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.421, P=0.036), Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)顯示有皮疹 SLE組較正常對照組CD4+CXCR5+百分比顯著降低(P=0.003)。
　　4.外周血中Tfh樣細(xì)胞與細(xì)胞因子、自身抗體、CD4+B細(xì)胞的關(guān)聯(lián):雙變量相關(guān)分析結(jié)果顯示CD4+CXCR5+ICOS+、CD4+ICOS+細(xì)胞百分比均與IL-21顯著正相關(guān)( r=0.235, P=0.030

11、;r=0.218, P=0.044), CD4+CXCR5+ICOS+、CD4+CXCR5+細(xì)胞百分比均與抗核小體抗體顯著正相關(guān)(r=0.377,P=0.008;r=0.314,P=0.030),CD4+ICOS+細(xì)胞百分比和抗β2GP1顯著正相關(guān)(rs=0.412, P=0.007), CD4+CXCR5+細(xì)胞百分比和 ANA、抗 SSA抗體均顯著正相關(guān)(rs=0.428,P=0.003;rs=0.366,P=0.011),CD4+I

12、COS+細(xì)胞百分比和抗RNP抗體顯著負(fù)相關(guān)(rs=-0.388,P=0.007)。
　　5. Bcl-6 mRNA、miRNAs的表達(dá)變化:SLE組和健康對照組的Bcl-6 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.478),SLE組的miR-302a、miR-339-5p、miR-346表達(dá)均顯著升高(P=0.027,P=0.003,P=0.036)。
　　6.不同miRNAs間的相互影響:分別對不同miRNAs的表達(dá)水平進(jìn)行

13、雙變量相關(guān)分析,結(jié)果顯示miR-346和miR-302a、miR-10a均呈顯著正相關(guān)(r=0.532, P=0.002;r=0.622,P=0.013),miR-127-3p和miR-9呈顯著正相關(guān)(r=0.860,P﹤0.001)。
　　7. miRNAs對Bcl-6 mRNA表達(dá)的影響:分別對不同miRNAs與Bcl-6 mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行雙變量相關(guān)分析,結(jié)果顯示miR-30a-5p和Bcl-6 mRNA呈顯著正相關(guān)(r

14、=0.585,P=0.022)。以Bcl-6 mRNA為因變量、miRNAs為自變量,采用逐步線性回歸發(fā)現(xiàn)miR-30a-5p、miR-127-3p、miR-10a和miR-302a的表達(dá)水平與 Bcl-6 mRNA有關(guān)?；貧w方程為 Yi=1.487+0.145 X1i-0.342 X2i+0.720 X3i-0.202 X4i(Yi表示 Bcl-6 mRNA表達(dá)水平,X1i、X2i、X3i、X4i分別表示miR-30a-5p、miR-

15、127-3p、miR-10a、miR-302a表達(dá)水平)。
　　8. Bcl-6與免疫球蛋白、自身抗體的關(guān)聯(lián):分別對Bcl-6 mRNA和IgG、IgA、IgM、抗 C1q、抗β2-GP1和抗核小體抗體等進(jìn)行雙變量相關(guān)分析,結(jié)果顯示Bcl-6 mRNA和抗核小體抗體呈顯著正相關(guān)(r=0.522,P=0.022)。
　　9. Bcl-6對Tfh樣細(xì)胞分化的影響:Bcl-6 mRNA與不同Tfh樣細(xì)胞群百分比分別進(jìn)行雙變量相關(guān)分

16、析,結(jié)果顯示Bcl-6 mRNA和各種Tfh樣細(xì)胞群百分比均無相關(guān)性。鑒于IL-21、CXCL13對Tfh細(xì)胞的影響,以IL-21和CXCL13為控制變量,Bcl-6 mRNA與不同Tfh樣細(xì)胞群百分比進(jìn)行雙變量偏相關(guān)分析,結(jié)果顯示 Bcl-6 mRNA和CD4+CXCR5+ICOS+細(xì)胞群百分比呈顯著偏相關(guān)(r=0.451,P=0.046)。
　　10. miRNAs對 Tfh樣細(xì)胞分化的影響:分別對不同 miRNAs的表達(dá)水平

17、Tfh細(xì)胞百分比進(jìn)行雙變量相關(guān)分析,結(jié)果顯示 miR-339-5p和CD4+CXCR5+ICOS+細(xì)胞百分比呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.409,P=0.042)。
　　結(jié)論:SLE患者外周血中可能存在Tfh細(xì)胞增殖,它們可能通過促進(jìn)IL-21和自身抗體的分泌參與SLE的發(fā)病;外周血Tfh細(xì)胞分化可能受IL-21、Bcl-6和miR-339-5p的影響;其中Bcl-6表達(dá)可能受到miR-127-3p等多種miRNAs的影響。SLE患者外