納米銀生理毒物動(dòng)力學(xué)模型(PBTK)構(gòu)建與驗(yàn)證.pdf

1、目的:
　　納米科技飛速發(fā)展，形成了眾多分支，如納米毒理學(xué)、納米生物學(xué)、納米藥物學(xué)和納米電子學(xué)等，由于具有與常規(guī)材料不同的光學(xué)、電學(xué)、熱學(xué)、力學(xué)或化學(xué)性能，納米材料被應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。納米銀是目前商品化程度最高的納米材料之一，因其具有獨(dú)特的廣譜抗菌性能，在衛(wèi)生、保健、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域廣泛使用。然而納米顆粒尺寸微小，易于通過血腦屏障、血睪屏障和血眼屏障等各種生物屏障并與體內(nèi)大分子發(fā)生相互作用，對(duì)人體可能具有潛在的危害，納米材料的安全性也備受

2、關(guān)注。
　　目前針對(duì)納米銀的毒理學(xué)研究主要集中于細(xì)胞培養(yǎng)體系等體外實(shí)驗(yàn)，并不能準(zhǔn)確反映納米銀進(jìn)入生物體的變化過程和對(duì)生物體的毒性作用。而已有的實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于通過各種途徑進(jìn)入生物體的納米銀在體內(nèi)的生物動(dòng)力學(xué)及生物學(xué)效應(yīng)研究尚不充分，因此有必要進(jìn)一步開展納米銀的體內(nèi)生物效應(yīng)研究以及相關(guān)的體內(nèi)生物動(dòng)力學(xué)研究，這對(duì)于納米銀的安全性評(píng)價(jià)及納米產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[4]。
　　生理毒代動(dòng)力學(xué)（Physiologically b

3、ased toxicokinetics，PBTK）模型以生理學(xué)和解剖學(xué)為基礎(chǔ)，通過血流將各個(gè)臟器和組織有機(jī)地聯(lián)系起來，反映毒物隨血流進(jìn)入各個(gè)臟器和組織，進(jìn)行轉(zhuǎn)化、代謝和排泄的過程。根據(jù)質(zhì)量守恒定律，通過微分方程，將毒物在各個(gè)臟器和組織的動(dòng)態(tài)變化描述出來，對(duì)方程組求解，便可以了解毒物隨著時(shí)間在各個(gè)臟器和組織的靶劑量。PBTK模型是一種新型劑量預(yù)測(cè)方法，能夠有效地預(yù)測(cè)生物體毒物內(nèi)暴露劑量，有助于定量地評(píng)估外暴露毒物劑量（外劑量）和內(nèi)暴露毒物

4、劑量（內(nèi)劑量）以及毒效應(yīng)之間的關(guān)系，是風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的新技術(shù)。
　　本研究使用兩種不同粒徑的納米銀材料AgNPs-20(20nm納米銀，PVP包被，標(biāo)示銀含量25％)和AgNPs-100（100nm納米銀，標(biāo)示銀含量99.5％），大鼠單次尾靜脈染毒，染毒濃度分別為120 mg/kg和30 mg/kg(以銀含量計(jì)，均為30mg/kg)。并設(shè)置陰性對(duì)照組PVP，染毒濃度為90 mg/kg。同時(shí)設(shè)置硝酸銀AgNO3作為納米銀在體內(nèi)可能釋放銀

5、離子的對(duì)照，染毒濃度為5 mg/kg(以銀含量計(jì)，為3.2 mg/kg)。研究大鼠染毒后急性毒性作用、血液動(dòng)力學(xué)、組織分布、排泄情況。并在此基礎(chǔ)之上，通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，利用Acsl軟件初步建立PBTK模型，通過實(shí)驗(yàn)所得的納米銀體內(nèi)數(shù)據(jù)驗(yàn)證與優(yōu)化模型。為研究納米銀材料的健康效應(yīng)及安全性評(píng)價(jià)提供依據(jù)。
　　方法:
　　1.納米銀材料表征:①使用TEM和SEM觀測(cè)形態(tài)特征，粒徑大小;②使用馬爾文粒度儀測(cè)定納米銀在生理鹽水中的水合粒

6、徑。③使用ICP-MS檢測(cè)納米銀材料實(shí)際銀含量。
　　2.納米銀對(duì)大鼠的急性毒性研究:大鼠單次尾靜脈染毒，于染毒后1d，7d，14d處死，取血清、臟器、尿液標(biāo)本。①觀測(cè)一般性指標(biāo)和臟器系數(shù)的變化;②血清和尿生化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)，包括:肝功能指標(biāo)(TP，ALB，ALT，AST，ALP)、心功能指標(biāo)(CK，CK-MB)、腎功能指標(biāo)(BUN，UP，UA，Cre);③觀察組織病理改變。
　　3.納米銀在大鼠體內(nèi)的血液動(dòng)力學(xué)和生物分布研究:

7、①血液動(dòng)力學(xué)研究:大鼠麻醉后行股靜脈插管手術(shù)，尾靜脈染毒后，通過股靜脈經(jīng)時(shí)(5 min，10 min，20 min，30 min，1h，2h，4h，6h)取血，ICP-MS檢測(cè)血中銀含量，應(yīng)用DAS藥物動(dòng)力學(xué)軟件計(jì)算相關(guān)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，進(jìn)行血液動(dòng)力學(xué)研究。②組織分布研究:大鼠單次尾靜脈染毒，于染毒后1d，7d，14d處死，ICP-MS檢測(cè)腦、心、肺、肝、脾和腎各組織臟器中的銀含量，進(jìn)行納米銀體內(nèi)分布研究;③排泄途徑研究:大鼠染毒后于不同時(shí)間

8、收集尿液和糞便，ICP-MS檢測(cè)糞便和尿液中銀含量，進(jìn)行納米銀排泄研究。
　　4.納米銀PBTK模型構(gòu)建與驗(yàn)證:①查閱文獻(xiàn)收集大鼠的生理參數(shù)以及納米銀相關(guān)的生化參數(shù)，確立模型的結(jié)構(gòu)和微分方程組，應(yīng)用Acsl軟件編寫程序，構(gòu)建PBTK模型。②利用已有的大鼠體內(nèi)納米銀染毒數(shù)據(jù)，驗(yàn)證與優(yōu)化PBTK模型。
　　結(jié)果:
　　1.納米銀材料表征:AgNPs-20呈球形，分散良好，平均粒徑21.54 nm，平均水合粒徑為43.76

9、nm，含銀量29.08％。AgNPs-100呈橢球形，平均粒徑79.04nm，平均水合粒徑為952.10 nm，含銀量99.84％。
　　2.納米銀對(duì)大鼠的急性毒性研究:①一般性指標(biāo)和臟器系數(shù)的影響:與PVP對(duì)照組相比，AgNPs-20、AgNPs-100和AgNO3染毒后的大鼠毛色輕微灰暗，攝食和飲水減少，染毒3天左右恢復(fù)。染毒1d后，與PVP對(duì)照組相比，AgNO3染毒組的肝臟臟器系數(shù)增大，AgNPs-20染毒組和AgNPs-1

10、00染毒組肝臟臟器系數(shù)降低(P＜0.05)。②血清及尿液生化指標(biāo)的影響:染毒1d時(shí)，與PVP對(duì)照組相比，AgNO3染毒組的TP含量下降，AgNPs-20染毒組的AST含量上升，AgNPs-100染毒組的ALT和AST含量上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05)。染毒7d時(shí)，與PVP對(duì)照組相比，AgNPs-20染毒組和AgNPs-100染毒組的AST含量上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，其他指標(biāo)和PVP對(duì)照組相比無顯

11、著差異。③組織病理學(xué)檢查:染毒7d后，與PVP對(duì)照組相比AgNPs-20染毒組和AgNPs-100染毒組大鼠肝臟有輕微病變，染毒1d、14d后，各組織病理學(xué)檢查無異常。
　　3.納米銀在大鼠體內(nèi)的血液動(dòng)力學(xué)和生物分布研究:①血液動(dòng)力學(xué):兩組納米銀染毒組血銀水平在1h內(nèi)均呈快速下降趨勢(shì)，1h～6h維持穩(wěn)定。AgNO3染毒組大鼠的血銀水平下降速度很快，在10 min時(shí)趨于穩(wěn)定。采用DAS藥物動(dòng)力學(xué)軟件計(jì)算，經(jīng)統(tǒng)計(jì)矩分析，AgNPs-2

12、0、AgNPs-100和AgNO3組的主要?jiǎng)恿W(xué)參數(shù)為:血液銀含量-時(shí)間曲線下面積(AUC，mg/L*h)分別為:57.41±28.21，106.99±11.60，55.88±9.26;平均滯留時(shí)間(MRT，h)分別為0.54±0.27，1.88±0.11，2.57±0.11;消除半衰期(t1/2，h)分別為0.80±0.30，1.88±0.23，6.06±4.67;清除率（CL，L/h*kg）分別為0.63±0.35，0.25±0.0

13、3，0.04±0.02;分布容積（Vd，L/kg）分別為0.79±0.70，0.68±0.07，0.23±0.04。②組織分布:尾靜脈注射納米銀后，在腦、心、肺、肝、脾和腎各主要臟器中均可檢測(cè)到不同水平的銀。染毒1d時(shí)，AgNPs-20主要分布在肝臟和脾臟，AgNPs-100主要分布在肺臟，AgNO3主要分布在肝臟;染毒14d時(shí)，兩納米銀組的主要分布組織均為肝臟和脾臟。AgNO3主要分布于肝臟、脾臟和腎臟。③排泄途徑:糞便和尿液14d累

14、積排泄率分別為:AgNPs-20(6.97％，0.15％)，AgNPs-100(4.40％，0.11％)，AgNO3(22.06％，7.60％)。糞便為納米銀主要排泄途徑。
　　4.PBTK模型構(gòu)建與驗(yàn)證結(jié)果:①通過收集大鼠生理學(xué)參數(shù)，納米銀生化指標(biāo)，編譯微分方程，初步構(gòu)建AgNPs-20和AgNPs-100在大鼠體內(nèi)的PBTK模型。②使用回歸分析方法比較動(dòng)物實(shí)驗(yàn)肝臟、血液數(shù)據(jù)與模型擬合數(shù)據(jù)，表明該模型對(duì)實(shí)際數(shù)據(jù)擬合較好，血液擬合

15、數(shù)據(jù)Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.774和0.754。
　　結(jié)論:
　　大鼠尾靜脈染毒30 mg/kg AgNPs-20和AgNPs-100后，體重、臟器系數(shù)和血清生化學(xué)和組織病理學(xué)改變提示大鼠的肝臟出現(xiàn)了輕微的急性毒性效應(yīng)。體內(nèi)動(dòng)力學(xué)和生物分布研究結(jié)果表明納米銀在大鼠體內(nèi)各主要臟器均有分布，特別是在腦組織中也有檢出，說明納米銀或銀離子可穿透血腦屏障進(jìn)入腦組織。不同粒徑納米銀在體內(nèi)分布模式有所不同，染毒1d后，AgNPs-

16、20主要分布在肝臟和脾臟中，AgNPs-100在肺臟濃度最高、肝臟和脾臟次之。染毒14d后，主要分布器官均為肝臟和脾臟，AgNPs-20組肝脾銀濃度為AgNPs-100組的6～7倍，認(rèn)為肝臟和脾臟為納米銀蓄積和作用靶器官，小尺寸納米銀在靶器官中蓄積更嚴(yán)重。排泄途徑研究表明，納米銀進(jìn)入大鼠體內(nèi)后主要經(jīng)糞便排泄，14d內(nèi)經(jīng)尿液排泄量?jī)H為糞便排泄量的2％～2.5％，AgNPs-20的排泄速率比AgNPs-100略快，銀離子進(jìn)入大鼠體內(nèi)也主要經(jīng)