轉(zhuǎn)Cecropin B基因柑橘對黃龍病抗性的研究.pdf

1、柑橘黃龍病是一種具有毀滅性危害的細菌性病害，給柑橘的產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來了極大危害。由于目前尚未在柑橘品種中找到對黃龍病有抗性的基因型，而基因工程育種具有效率高、周期短、可控性強等優(yōu)點，因此利用基因工程技術(shù)開展柑桔黃龍病抗性育種受到了廣泛的關(guān)注。抗菌肽，作為一種具有廣譜殺菌活性的小分子物質(zhì)，已被成功用于多種作物的抗病性研究。有離體研究表明，來源于柞蠶的抗菌肽對黃龍病病原菌有一定抗菌活性，然而，其在柑橘體內(nèi)的抗菌活性有待研究。本實驗室研究人員針對

2、以上問題設(shè)計了由韌皮部特異啟動子和組成型啟動子調(diào)控Cecropin B（CB）抗菌肽基因表達的載體，經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)基因錦橙和血橙，由韌皮部特異啟動子調(diào)控的的轉(zhuǎn)基因株系共67個，其中RTBV（RT）37個，GRP（GR）30個，由組成型啟動子（CaMV35S，CA）調(diào)控的轉(zhuǎn)基因植株7個。
　　本研究利用上述轉(zhuǎn)基因植株，通過嫁接黃龍病亞洲種（Candidatus Liberibacter asiaticus）進行傳毒試驗，熒光定量P

3、CR（qPCR）技術(shù)對黃龍病病原菌進行絕對定量，從而篩選出對黃龍病抗性增強的轉(zhuǎn)基因植株。在此基礎(chǔ)上，從抗菌肽基因的整合與表達特征（抗菌肽基因Southernblot分析、表達分析、RNA原位雜交、蛋白質(zhì)原位雜交）來分析轉(zhuǎn)基因植株抗性增強的可能機制，為進一步的研究提供參考，本研究主要結(jié)果如下：
　　1.病原菌含量分析用標準曲線的構(gòu)建
　　為定量檢測黃龍病病原菌在柑橘組織內(nèi)的含量，本研究建立了以植物DNA為內(nèi)參來檢測黃龍病的絕對

4、定量體系。來自黃龍病16s基因和來自柑橘的18s基因用于絕對定量體系的建立，在得到二者的標準品后，通過qPCR分析，得到黃龍病病原菌含量計算公式：每納克植物 DNA含病原菌的量=10^(10.624-0.2718*CT16S)/10^(4.0531-0.2749*CT18S)。再通過 SPSS軟件分析，篩選出與以非轉(zhuǎn)基因植株為對照病原菌含量差異顯著的植株。
　　2.抗性增強轉(zhuǎn)基因植株的篩選
　　根據(jù)1所得的絕對定量公式，結(jié)合

5、SPSS7.0軟件分析，在嫁接傳毒3個月后開始利用qPCR連續(xù)檢測12個月，共得到7株對黃龍病抗性顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株的轉(zhuǎn)基因植株，其中，組成型啟動子調(diào)控的轉(zhuǎn)基因植株1株(JC-CA-10)，韌皮部特異啟動子調(diào)控的6株。表型觀察發(fā)現(xiàn)，韌皮部特異啟動子調(diào)控的轉(zhuǎn)基因植株于嫁接傳毒8個月后開始陸續(xù)顯癥，JC-CA-10在嫁接傳毒后20個月仍未有明顯的癥狀，而非轉(zhuǎn)基因植株在嫁接傳毒6個月后就開始顯癥。
　　3.轉(zhuǎn)基因植株中Cecropin

6、 B基因的表達及整合分析
　　提取抗性增強的轉(zhuǎn)基因植株的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以actin為內(nèi)參，非轉(zhuǎn)基因植株為對照，qPCR結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株的CB基因得到有效的表達量，組成型啟動子調(diào)控的轉(zhuǎn)基因植株其表達量顯著高于韌皮部啟動子調(diào)控的轉(zhuǎn)基因植株。本試驗通過Southern blot分析發(fā)現(xiàn)，抗性增強的植株JC-RT-5、JC-RT-25、XC-GR-14為單拷貝，JC-GR-32、JC-CA-10、JC-RT-3為兩個拷貝，