轉Cecropin B基因柑橘對黃龍病抗性的研究.pdf

1、柑橘黃龍病是一種具有毀滅性危害的細菌性病害，給柑橘的產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來了極大危害。由于目前尚未在柑橘品種中找到對黃龍病有抗性的基因型，而基因工程育種具有效率高、周期短、可控性強等優(yōu)點，因此利用基因工程技術開展柑桔黃龍病抗性育種受到了廣泛的關注。抗菌肽，作為一種具有廣譜殺菌活性的小分子物質，已被成功用于多種作物的抗病性研究。有離體研究表明，來源于柞蠶的抗菌肽對黃龍病病原菌有一定抗菌活性，然而，其在柑橘體內的抗菌活性有待研究。本實驗室研究人員針對

2、以上問題設計了由韌皮部特異啟動子和組成型啟動子調控Cecropin B（CB）抗菌肽基因表達的載體，經(jīng)遺傳轉化得到轉基因錦橙和血橙，由韌皮部特異啟動子調控的的轉基因株系共67個，其中RTBV（RT）37個，GRP（GR）30個，由組成型啟動子（CaMV35S，CA）調控的轉基因植株7個。
　　本研究利用上述轉基因植株，通過嫁接黃龍病亞洲種（Candidatus Liberibacter asiaticus）進行傳毒試驗，熒光定量P

3、CR（qPCR）技術對黃龍病病原菌進行絕對定量，從而篩選出對黃龍病抗性增強的轉基因植株。在此基礎上，從抗菌肽基因的整合與表達特征（抗菌肽基因Southernblot分析、表達分析、RNA原位雜交、蛋白質原位雜交）來分析轉基因植株抗性增強的可能機制，為進一步的研究提供參考，本研究主要結果如下：
　　1.病原菌含量分析用標準曲線的構建
　　為定量檢測黃龍病病原菌在柑橘組織內的含量，本研究建立了以植物DNA為內參來檢測黃龍病的絕對

4、定量體系。來自黃龍病16s基因和來自柑橘的18s基因用于絕對定量體系的建立，在得到二者的標準品后，通過qPCR分析，得到黃龍病病原菌含量計算公式：每納克植物 DNA含病原菌的量=10^(10.624-0.2718*CT16S)/10^(4.0531-0.2749*CT18S)。再通過 SPSS軟件分析，篩選出與以非轉基因植株為對照病原菌含量差異顯著的植株。
　　2.抗性增強轉基因植株的篩選
　　根據(jù)1所得的絕對定量公式，結合

5、SPSS7.0軟件分析，在嫁接傳毒3個月后開始利用qPCR連續(xù)檢測12個月，共得到7株對黃龍病抗性顯著高于非轉基因植株的轉基因植株，其中，組成型啟動子調控的轉基因植株1株(JC-CA-10)，韌皮部特異啟動子調控的6株。表型觀察發(fā)現(xiàn)，韌皮部特異啟動子調控的轉基因植株于嫁接傳毒8個月后開始陸續(xù)顯癥，JC-CA-10在嫁接傳毒后20個月仍未有明顯的癥狀，而非轉基因植株在嫁接傳毒6個月后就開始顯癥。
　　3.轉基因植株中Cecropin

6、 B基因的表達及整合分析
　　提取抗性增強的轉基因植株的RNA，反轉錄成cDNA，以actin為內參，非轉基因植株為對照，qPCR結果表明，轉基因植株的CB基因得到有效的表達量，組成型啟動子調控的轉基因植株其表達量顯著高于韌皮部啟動子調控的轉基因植株。本試驗通過Southern blot分析發(fā)現(xiàn)，抗性增強的植株JC-RT-5、JC-RT-25、XC-GR-14為單拷貝，JC-GR-32、JC-CA-10、JC-RT-3為兩個拷貝，