柑橘黃龍病Serralysin蛋白的重組表達和純化.pdf

1、柑橘黃龍病是世界柑橘生產(chǎn)中最具毀滅性的病害,目前對柑橘黃龍病的致病機理還不清楚。對治病機理的研究一般著眼于對治病基因或相關(guān)蛋白的功能分析上,分泌蛋白就是這樣一類被人們所關(guān)注的分子。Ⅰ型分泌系統(tǒng)在細菌中行使蛋白主動運輸功能,其運輸機制被研究的較為清楚,通過其分泌進攻性的蛋白分子是細菌作用于寄主的一個主要途徑。
　　 本研究根據(jù)GenBank上的全基因組序列,設(shè)計了引物,擴增到了柑橘黃龍病中的Ⅰ型分泌蛋白基因(COG2931),并構(gòu)

2、建了它的重組表達載體,在大腸桿菌中進行了表達,并對表達出的蛋白進行了分離和純化。主要獲得了一下結(jié)果:
　　 1.從長春花感病葉片中提取了黃龍病病原菌的基因組DNA,并用PCR方法和電子顯微鏡觀察的方法進行了驗證。利用提取的DNA成功擴增了柑橘黃龍病中的Serralysin基因,得到的片段長度為2089bp,經(jīng)測序和比對,發(fā)現(xiàn)該基因確實屬于Serralysin家族,并在其序列中發(fā)現(xiàn)了3個保守結(jié)構(gòu)域,和3個串聯(lián)重復的區(qū)域。
　

3、　 2.我們對該基因設(shè)計了基于pET-22b(+)的重組表達載體,使其與組氨酸標簽融合表達,再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)細胞內(nèi)進行了誘導表達。對誘導表達的條件進行了篩選,得到的最適表達條件為將菌液在37℃下振蕩培養(yǎng)到OD600～0.6,加入0.4mM的IPTG,然后在28℃下繼續(xù)培養(yǎng)3.5小時。
　　 3.誘導表達得到的蛋白進行了分離和純化,方法為硫酸沉淀和Ni柱親和層析。最后得到的蛋白純度為99％,蛋白的回收率為1％。