柑橘黃龍病昆蟲介體-柑橘木虱的研究及九里香感染黃龍病菌后的差減文庫構(gòu)建.pdf

1、柑橘黃龍病,也稱作青果病,是柑橘上最嚴(yán)重的病害之一。黃龍病防治至今還沒有有效的根治方法。柑橘木虱(Diaphorina citri)是黃龍病唯一的傳播媒介。九里香(Murrava paniculata)為蕓香科植物九里香屬植物,是柑橘木虱最喜食的植物之一,感染黃龍病后很少表現(xiàn)癥狀。九里香作為抗黃龍病材料已有研究,但關(guān)于九里香感染黃龍病菌后基因表達(dá)情況研究很少。
　　 本研究采集田間具有典型黃龍病癥狀的樣品,并對樣品嫁接進行室內(nèi)生

2、物學(xué)鑒定、PCR擴增確定柑橘黃龍病陽性樣品。在室外自然條件下研究柑橘木虱對福建茶和蕓香科植物的選擇性,觀察柑橘木虱在福建茶和九里香上的生活周期,并在室內(nèi)條件下研究柑橘木虱不同齡期若蟲和成蟲的饑渴耐受時間。采用不同濃度海芋乙醇提取物處理柑橘木虱若蟲和成蟲,采用夾毒葉片法分別測定提取物對柑橘木虱致死率,研究海芋提取物對柑橘木虱的生物活性。比較九里香感染黃龍病的不同途徑,找出最佳感染途徑后,收集感染黃龍病的九里香作為研究材料,應(yīng)用SSH方法構(gòu)

3、建了九里香感染黃龍病早期的差減cDNA文庫,分離獲得在黃龍病病程相關(guān)的相關(guān)的cDNA片段,從中篩選出與抗性相關(guān)的基因片段。利用高效熱不對稱PCR技術(shù)擴增感染黃龍病菌的九里香的STH-21的cDNA全長,旨在克隆九里香上與黃龍病相關(guān)蛋白的STH-21蛋白的全長定量檢測表達(dá)情況。本文主要研究結(jié)果如下:
　　 柑橘木虱可在福建茶和九里香上生存繁殖,兩者若蟲歷期和成蟲歷期差異較大,福建茶上若蟲期(15.0-20d),成蟲期(17-19d

4、),對照九里香上分別是15.0～17.0d和20.0～23.0d,福建茶上生活周期和九里香上相近,福建茶上為39.0-44.0d,九里香為39.0-45.0d九里香上若蟲發(fā)育為成蟲成活率為16.9％。比九里香低。福建茶對柑橘木虱是一種可接受寄主而不是最適合的寄主.柑橘木虱對寄主選擇性測定顯示該蟲在選擇各寄主之間差異明顯,最適寄主為黃皮和九里香,其次是檸檬,沙田柚、紅江橙和椏柑差異不大,很少取食枳殼。耐饑渴能力測試結(jié)果表明,低齡若蟲和高齡

5、若蟲在供水缺食物時平均存活時間分別為10.0～12.0h和39.0～40.0 h,成蟲可存活69.0～75.0h；在缺水供食物的條件下,平均存活時間分別為8.0～8.8h和35.0～37.0h,成蟲為48.0～50.0h,在缺水缺食物的情況下,平均存活為7.7～8.2 h和15.0～18.0左右,成蟲為36.0～38.0h。水分能延長柑橘木虱存活時間,成蟲的耐受能力強于若蟲。海芋揮發(fā)性物質(zhì)和不同濃度乙醇提取物毒殺效果表明:揮發(fā)性氣體物質(zhì)

6、0.5h內(nèi)對柑橘木虱有強效毒殺作用。各級濃度提取物乙醇溶液對柑橘木虱成蟲和若蟲均有不同程度的殺滅效果。10克/100mL對木虱才有很強的毒殺作用,3h時每組死亡的平均數(shù)量為9.3,7h后幾乎全部死亡,校正死亡率分別為45.6％和98.4％。提取物濃度為5克/100mL時,3H和24h后每組的平均校正死亡率分別為23.5％和71.0％。隨著濃度的降低到0.1克/100mL,平均校正死亡率分別為8.5％和11.5％基本失去了毒殺作用。

7、>　　 采用汁液摩擦、注射和擠壓法,接種2個月后不能在九里香植株體內(nèi)檢測到黃龍病菌；黃龍病陽性接穗紅江橙(Citrus sinensis Osbeck)嫁接九里香能使黃龍病菌成功侵染九里香,但接穗不能抽芽。草地菟絲子(Cuscuta campestris)和蟲媒柑橘木虱(Diaphorina citri)都能成功從陽性植株體內(nèi)將黃龍病菌傳播至九里香。柑橘木虱傳“毒”效率結(jié)果顯示:木虱在紅江橙陽性植株上取食1.5h-2h就能攜帶黃龍病菌

8、,病原從柑橘木虱傳到健康的九里香上最短需要12h,單頭木虱帶菌就能使九里香成功感染黃龍病菌。溫度對病原的傳播效率有較大影響,氣溫高于35℃或低于15℃時,介體昆蟲活力差,傳播病原的效率較低,0℃溫度下木虱幾乎不傳播病原。40℃時昆蟲死亡率高,活力差。
　　 采用抑制差減雜交技術(shù),構(gòu)建了柑橘黃龍病菌侵染九里香后不同時段的混合樣品SSH正向和反向文庫。Nest-PCR結(jié)果表明,插入片段大小平均為400 bp大小從0.2 kb到1kb

9、不等。通過反向Northern斑點雜交技術(shù)對兩個差減文庫中400個片段進行篩選(正向300個,反向100個),共獲得了167個差異EST表達(dá)片段。其中黃龍病菌誘導(dǎo)寄主上調(diào)表達(dá)的基因115個,下調(diào)表達(dá)的基因52個。利用BLASTn和BLASTx對所得EST進行相似性分析,結(jié)果顯示,目前在柑橘中報道的僅有10個,其它絕大部分來源于擬南芥、蓖麻屬、和番茄等。在167個ESTs片段中,36％尚不能推斷明確其功能,其余64％涉及抗病防御、轉(zhuǎn)錄、信

10、號轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量、代謝、蛋白質(zhì)合成等信號途徑,提示黃龍病菌與寄主互作是一個多基因參與的過程。研究結(jié)果對認(rèn)識黃龍病菌.寄主互作的分子機制和尋找抗病相關(guān)基因有理論與實踐意義。
　　 半定量PCR用來檢測文庫中miraculin-like protein,sthp2-21,ubiquitin-conjugating enzyme8,chlorophyll A/B binding protein片段感染黃龍病菌前期表達(dá)情況,結(jié)果顯示,mir

11、aculin-Iike protein,sthp2-21,ubiquitin-conjugating enzyme8屬于上調(diào)表達(dá)基因,chlorophyll A/B binding protein屬于下調(diào)表達(dá)基因,獲得了九里香病程相關(guān)蛋白STH21基因的cDNA全長序列。該基因與葡萄屬(fragaria)的同源性為68％,與馬鈴薯pSTH-21基因核酸序列的同源性為67％,與其它植物的同源性為50％～60％。半定量RT-PCR分析表明,