柑橘黃龍病的細(xì)胞病理及其寄主轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究.pdf

1、柑橘黃龍病（Citrus Huanglongbing，HLB）和柑橘衰退病(Tristeza)是世界柑橘產(chǎn)業(yè)的兩大主要?dú)缧圆『Γ陙戆l(fā)生加重。前者在近50個(gè)國家有發(fā)生，后者分布更廣。2004和2005年分別在巴西和美國發(fā)現(xiàn)黃龍病，該病已使佛羅里達(dá)柑橘產(chǎn)業(yè)產(chǎn)量銳減一半，引起了政府和科研工作者的高度關(guān)注?，F(xiàn)已知黃龍病病原為韌皮部桿菌屬細(xì)菌，可分為三個(gè)暫定種:亞洲種（‘Candidatus Liberibacterasiaticus’，C

2、aLas）、非洲種（‘Ca.L.africanus’，CaLaf）和美洲種（‘Ca.L.americanus’，CaLam），目前，CaLas是分布最廣危害最大的一個(gè)種。該病菌可通過嫁接和木虱（Diaphorina citri, Trioza erytreae and Cacopsylla citrisuga）傳播，幾乎能侵染所有柑橘類植株，植株感病后，葉片主要表現(xiàn)斑駁黃化、均勻黃化和缺素黃化癥狀，果實(shí)著色不均、畸形、紅鼻果，產(chǎn)量減少及

3、果實(shí)品質(zhì)降低，給產(chǎn)業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。衰退病病原為長線形病毒科(Closteroviridae)下長線形病毒屬（Closterovirus）的柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV），可通過嫁接和蚜蟲(Toxoptera citricidus,T.aurantii, Aphis gossypii,A.spiraecola and Myzus persicae)傳播，是目前已知基因組最大的植物病毒之一。根據(jù)衰退病

4、毒侵染指示植物表現(xiàn)的癥狀，可分為強(qiáng)毒株系和弱毒株系，根據(jù)其引起指示植物表現(xiàn)的癥狀可分為三種類型:速衰型(Quick decline，QD)、莖陷點(diǎn)型（Stem pitting，SP）和苗黃型(Seedingyellow, SY)。柑橘植株被CaLas或CTV強(qiáng)毒株系單獨(dú)侵染或兩者復(fù)合侵染后會(huì)產(chǎn)生一些相似癥狀，如葉片黃化、固化、船型葉，根系衰退，韌皮部壞死等，而被衰退病毒弱毒株系侵染后，幾乎對(duì)寄主沒有影響。目前，沒有抗黃龍病的柑橘品種，也

5、無特效防治藥劑，一旦感染，最有效的辦法是砍除病樹，而CTV強(qiáng)毒株系可以通過抗病品種或弱毒株系交叉保護(hù)措施到達(dá)一定防控效果。
　　本文對(duì)接種CaLas的甜橙植株進(jìn)行病理解剖，系統(tǒng)觀察其細(xì)胞病變情況，以期從細(xì)胞水平上闡釋該菌對(duì)甜橙植株的影響;通過觀察CaLas分別和CTV強(qiáng)弱毒株系復(fù)合侵染甜橙植株后的生物學(xué)癥狀，探索病原間及其與寄主的表型互作關(guān)系;進(jìn)一步對(duì)甜橙植株分別在CaLas和CTV強(qiáng)弱毒株系脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄組學(xué)開展對(duì)比研究，以期

6、從轉(zhuǎn)錄分子水平了解韌皮部系統(tǒng)性寄生病原對(duì)甜橙植株的影響和植株對(duì)病原的應(yīng)對(duì)反應(yīng)，從而利于對(duì)病原-寄主互作的分子機(jī)理以及從轉(zhuǎn)錄分子水平上對(duì)生物學(xué)結(jié)果的理解，研究結(jié)果可為尋找黃龍病防控新途徑奠定一定的理論基礎(chǔ)。
　　現(xiàn)將本文研究結(jié)果摘要如下:
　　1.世界上首次在柑橘樣品中觀察到CaLas噬菌體，對(duì)CaLas感染甜橙的細(xì)胞病變觀察更為系統(tǒng)。通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)CaLas噬菌體，這是世界上首次在柑橘細(xì)胞中觀察到噬菌體的直接證據(jù)，噬菌體的

7、存在形式可能與CaLas在植株體內(nèi)的濃度相關(guān)。大量淀粉粒和嗜鋨顆粒分別在葉綠體內(nèi)和葉綠體表面積累，胼胝質(zhì)在胞間連絲孔隙單元(PPUs)堆積以及異形晶體細(xì)胞形成。淀粉粒與植物體內(nèi)碳水化合物代謝相關(guān)，嗜鋨顆粒與生物脅迫相關(guān)，胼胝質(zhì)的積累與植物早期防御反應(yīng)相關(guān)，異形晶體細(xì)胞與鈣濃度相關(guān)，鈣能夠調(diào)控植物體內(nèi)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和激發(fā)依賴鈣的植物防御反應(yīng)，如胼胝質(zhì)的形成。因此在CaLas脅迫下，植物體內(nèi)的碳水化合物和鈣離子代謝失衡，胼胝質(zhì)相關(guān)的植物早期防

8、御系統(tǒng)被激活。
　　2.衰退病毒弱毒株系CTV-B2在甜橙植株定殖后顯著降低HLB的發(fā)生率和癥狀。通過實(shí)驗(yàn)組Ⅰ同時(shí)復(fù)合嫁接CTV-B2/CaLas-B232、衰退病毒強(qiáng)毒株系CTV-B6/CaLas-B232及CTV-B2/CTV-B6，與實(shí)驗(yàn)組Ⅱ先嫁接CaLas-232，待其在植株中定殖后，再嫁接CTV的比較發(fā)現(xiàn):組Ⅰ中，CTV先于CaLas-B232在植株中定殖，并對(duì)之后CaLas-B232的定殖有一定影響，尤其是CTV-B2

9、顯著降低了HLB的發(fā)生率;組Ⅱ中CaLas-B232在植株中的定殖對(duì)之后CTV-B2和CTV-B6的定殖均沒有影響;同時(shí)復(fù)合嫁接CTV-B2/CTV-B6時(shí)，對(duì)相互間的定殖也沒有影響。此外，再次證明CaLas在根中的定殖先于葉，這預(yù)示根可作為該病早期檢測的有效部位。
　　3.甜橙植株分別被三個(gè)病原脅迫后差異表達(dá)基因的數(shù)量和轉(zhuǎn)錄組變化的復(fù)雜性，均與相應(yīng)病原引起癥狀的復(fù)雜性具有一致性。與健康植株相比，甜橙植株分別被CTV-B2、CTV

10、-B6和CaLas-B232脅迫后，上調(diào)表達(dá)基因比下調(diào)表達(dá)基因多;CaLas-B232脅迫甜橙植株差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本（589個(gè)轉(zhuǎn)錄本上調(diào)表達(dá)，22個(gè)轉(zhuǎn)錄本下調(diào)表達(dá)），是CTV-B6脅迫甜橙植株差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本（328個(gè)轉(zhuǎn)錄本上調(diào)表達(dá)，76轉(zhuǎn)錄本下調(diào)表達(dá)）的1.5倍，是CTV-B2脅迫甜橙植株差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本(243個(gè)轉(zhuǎn)錄本上調(diào)表達(dá)，42個(gè)轉(zhuǎn)錄本下調(diào)表達(dá))的2倍。三個(gè)病原均為韌皮部專性寄生病原，植株被CaLas-B232脅迫后，產(chǎn)生的癥狀最為復(fù)

11、雜，如葉片斑駁黃化、均勻黃化、缺素黃化和固化，紅鼻果和斜果，韌皮部壞死，根系退化等;被CTV-B6脅迫甜橙植株產(chǎn)生的癥狀復(fù)雜性次之，包括葉片黃化、固化，韌皮部壞死等，被CTV-B2脅迫后幾乎沒有影響。所以，三個(gè)病原分別脅迫甜橙植株的差異表達(dá)基因的數(shù)量，在一定程度上反映了相應(yīng)病原脅迫甜橙植株產(chǎn)生癥狀的復(fù)雜性。CTV-B6和CaLas-B232分別脅迫甜橙植株的共同差異表達(dá)基因數(shù)，比兩個(gè)CTV株系或組合Ⅰ（CTV-B2和CaLas-B232

12、）分別脅迫甜橙植株的量要大，且GO功能相似性亦大。其中，被三個(gè)病原分別脅迫而共同上調(diào)表達(dá)的有50個(gè)轉(zhuǎn)錄本，共同下調(diào)表達(dá)的有2個(gè)轉(zhuǎn)錄本;CTV-B6和CaLas-B232分別脅迫甜橙植株共同差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本（105個(gè)轉(zhuǎn)錄本上調(diào)表達(dá)，2個(gè)轉(zhuǎn)錄本下調(diào)表達(dá)）約是兩個(gè)CTV株系（27個(gè)轉(zhuǎn)錄本上調(diào)表達(dá)，0轉(zhuǎn)錄本下調(diào)表達(dá)）或組合Ⅰ（22個(gè)轉(zhuǎn)錄本上調(diào)表達(dá)，3個(gè)轉(zhuǎn)錄本下調(diào)表達(dá)）分別脅迫甜橙植株共同差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的3.5倍。同時(shí)，通過PlantGSEA的G

13、O功能富集差異表達(dá)基因發(fā)現(xiàn):CTV-B6和CaLas-B232分別脅迫甜橙植株的差異表達(dá)基因主要與多種生物學(xué)過程(BPs)相關(guān)，如生物脅迫、防御反應(yīng)、信號(hào)傳導(dǎo)，而CTV-B2脅迫甜橙植株差異表達(dá)的基因主要與分子功能(MFs)和細(xì)胞成分(CCs)相關(guān)。由于CTV-B6和CaLas-B232分別脅迫甜橙植株產(chǎn)生癥狀的相似性比兩個(gè)CTV株系或組合Ⅰ分別脅迫甜橙植株產(chǎn)生癥狀的相似性大，所以轉(zhuǎn)錄組水平變化的相似性一定程度反映了相應(yīng)病原脅迫甜橙植株

14、產(chǎn)生癥狀的相似性。
　　4.甜橙植株分別被三個(gè)病原脅迫后，其生理系統(tǒng)和離子代謝失衡，多種相似植物防御反應(yīng)被激活，但有差異。通過分析差異表達(dá)基因發(fā)現(xiàn)，與生理系統(tǒng)相關(guān)的基因如PRR5、PRR7、GI分別被三個(gè)病原脅迫差異表達(dá)，表明甜橙植株分別在三個(gè)病原，尤其是CTV-B6脅迫下，生理系統(tǒng)嚴(yán)重受到影響。同時(shí)，Zn、Cu和Ca等離子相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的差異表達(dá)，表明植株體內(nèi)相關(guān)離子代謝失衡。盡管分別在三個(gè)病原脅迫下，甜橙植株的多種相似防御反

15、應(yīng)機(jī)制被激活，但存在一定差異:1）與細(xì)胞壁和次生產(chǎn)物代謝相關(guān)的防御反應(yīng)在CTV-B2脅迫甜橙植株中表現(xiàn)得更顯著，2）與轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)相關(guān)的防御反應(yīng)在CTV-B6脅迫甜橙植株中表現(xiàn)的更顯著，3）與激素調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)和抗病蛋白相關(guān)的防御反應(yīng)在CaLas-B232脅迫甜橙植株中表現(xiàn)的更顯著。
　　5.甜橙植株被黃龍病菌脅迫后轉(zhuǎn)錄組水平變化與電鏡觀察到的細(xì)胞病變具有一致性。黃龍病菌脅迫甜橙植株后引起植株胼胝質(zhì)合成和Zn離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等相關(guān)基因

16、的差異表達(dá)，與電鏡觀察到的黃龍病菌脅迫甜橙植株后引起的胼胝質(zhì)的積累及缺鋅癥狀相呼應(yīng)。
　　6.Gfold與RT-qPCR結(jié)果具有一致性。Gfold是用于分析RNA-seq數(shù)據(jù)的程序，可通過計(jì)算基因的倍數(shù)變化找出差異表達(dá)基因。該程序基于Poisson分布設(shè)計(jì)，將基因長度和表達(dá)量同時(shí)考慮，避免了基因低表達(dá)量、高差異性或高表達(dá)量、低差異性的缺點(diǎn)，尤其適用于沒有重復(fù)測序數(shù)據(jù)的樣品。根據(jù)Gfold值和基因功能篩選了38個(gè)基因進(jìn)行RT-qPC