小鼠Dectin-1胞外識別區(qū)的融合表達(dá)及其識別真菌細(xì)胞壁β-葡聚糖的研究.pdf

1、隨著免疫抑制劑的大量使用，臨床上發(fā)生深部真菌感染的患者越來越多，而對這些患者的治療成功與否，很大程度上取決于能否快速檢測出入侵的病原菌。目前，已有大量研究通過檢測體液中真菌抗原或代謝物來快速診斷深部真菌感染，其中以真菌細(xì)胞壁成分-β-葡聚糖檢測應(yīng)用較廣。但由于其易受細(xì)菌內(nèi)毒素影響，現(xiàn)行方法存在假陽性高等缺陷，進一步探討具有較高特異性的真菌檢測方法刻不容緩。
　　 β-葡聚糖是真菌細(xì)胞壁的保守成分，由β-1，3連接的β-D-葡聚糖

2、構(gòu)成主鏈，β-1，6連接的葡聚糖隨機散在分布為支鏈所組成，可作為病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）被機體細(xì)胞表面的模式識別受體識別（pattern recognition receptors，PRRs），從而誘導(dǎo)機體免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗感染等生物效應(yīng)。因此，β-葡聚糖是與真菌感染相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物。Dectin-1（Dentric cell-associated C-

3、typelectin-1）已被確認(rèn)為粒細(xì)胞上β-葡聚糖的主要受體，為一種Ⅱ型跨膜蛋白，包含一個單獨的細(xì)胞外C型凝集素樣糖識別區(qū)域（C-typecarbohydrate recognition domain，CRD）和胞漿內(nèi)的一個免疫受體酪氨酸活化樣基序區(qū)域（immunoreceptor tyrosine-based activation moilf，ITAM），可特異性識別β-1，3連接和β-1，6連接的葡聚糖，甚至整個酵母菌顆粒。本研

4、究擬通過構(gòu)建小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Dectin-1 CRD的原核表達(dá)載體，進行體外融合表達(dá)和親和純化的方法獲得大量Dectin-1CRD融合蛋白；并進一步觀察該可溶性融合蛋白識別常見真菌細(xì)胞壁上β-葡聚糖的能力，以評估是否可將其用于真菌感染診斷以提高檢測特異性。本研究共分為以下三個部分：
　　 （一）小鼠Dectin-1融合蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定：以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞總RNA為模板進行RT-PCR，獲得Dectin-1的細(xì)胞外區(qū)域

5、，將其連接到原核表達(dá)載體pET28a（+）中，獲得重組質(zhì)粒pET28-Dectin-1；再通過菌落PCR挑選陽性重組質(zhì)粒進行雙酶切和DNA測序鑒定；結(jié)果顯示：重組質(zhì)粒pET28-Dectin-1測序結(jié)果與GenBank相應(yīng)序列（登錄號AF262985）完全吻合，且插入片段讀碼框與表達(dá)載體讀碼框相一致。說明含有Dectin-1基因CRD片段的pET28-Dectin-1重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 （二）小鼠Dectin-1融合蛋白的

6、表達(dá)、純化、復(fù)性與鑒定：將pET28-Dectin-1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）表達(dá)菌感受態(tài)細(xì)胞中，并以空質(zhì)粒pET28a（+）及未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的E.coli BL21（DE3）為對照，在不同的溫度和時間條件下加入IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE確定融合蛋白表達(dá)的最佳條件和形式。研究結(jié)果顯示：重組質(zhì)粒工程菌表達(dá)蛋白于23KD處檢測出特異性陽性信號，即小鼠Dectin-1融合蛋白，且該融合蛋白在包涵體中表達(dá)量明顯高于上

7、清可溶性蛋白。結(jié)果提示：pET28-Dectin-1重組質(zhì)粒在E.Coil BL21表達(dá)系統(tǒng)中大量表達(dá)小鼠Dectin-1融合蛋白，該融合蛋白主要以包涵體形式存在。收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后包涵體蛋白，經(jīng)溶解、純化、復(fù)性，即獲得可溶性Dectin-1融合蛋白。
　　 （三）小鼠Dectin-1融合蛋白體外識別常見真菌細(xì)胞壁β-葡聚糖的初步研究：采用免疫熒光顯微鏡技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)檢測Dectin-1融合蛋白體外結(jié)合白假絲酵母菌、光滑