小鼠Dectin-1胞外識(shí)別區(qū)的融合表達(dá)及其識(shí)別真菌細(xì)胞壁β-葡聚糖的研究.pdf

1、隨著免疫抑制劑的大量使用，臨床上發(fā)生深部真菌感染的患者越來(lái)越多，而對(duì)這些患者的治療成功與否，很大程度上取決于能否快速檢測(cè)出入侵的病原菌。目前，已有大量研究通過(guò)檢測(cè)體液中真菌抗原或代謝物來(lái)快速診斷深部真菌感染，其中以真菌細(xì)胞壁成分-β-葡聚糖檢測(cè)應(yīng)用較廣。但由于其易受細(xì)菌內(nèi)毒素影響，現(xiàn)行方法存在假陽(yáng)性高等缺陷，進(jìn)一步探討具有較高特異性的真菌檢測(cè)方法刻不容緩。
　　 β-葡聚糖是真菌細(xì)胞壁的保守成分，由β-1，3連接的β-D-葡聚糖

2、構(gòu)成主鏈，β-1，6連接的葡聚糖隨機(jī)散在分布為支鏈所組成，可作為病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）被機(jī)體細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體識(shí)別（pattern recognition receptors，PRRs），從而誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗感染等生物效應(yīng)。因此，β-葡聚糖是與真菌感染相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物。Dectin-1（Dentric cell-associated C-

3、typelectin-1）已被確認(rèn)為粒細(xì)胞上β-葡聚糖的主要受體，為一種Ⅱ型跨膜蛋白，包含一個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞外C型凝集素樣糖識(shí)別區(qū)域（C-typecarbohydrate recognition domain，CRD）和胞漿內(nèi)的一個(gè)免疫受體酪氨酸活化樣基序區(qū)域（immunoreceptor tyrosine-based activation moilf，ITAM），可特異性識(shí)別β-1，3連接和β-1，6連接的葡聚糖，甚至整個(gè)酵母菌顆粒。本研

4、究擬通過(guò)構(gòu)建小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Dectin-1 CRD的原核表達(dá)載體，進(jìn)行體外融合表達(dá)和親和純化的方法獲得大量Dectin-1CRD融合蛋白；并進(jìn)一步觀察該可溶性融合蛋白識(shí)別常見(jiàn)真菌細(xì)胞壁上β-葡聚糖的能力，以評(píng)估是否可將其用于真菌感染診斷以提高檢測(cè)特異性。本研究共分為以下三個(gè)部分：
　　 （一）小鼠Dectin-1融合蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定：以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR，獲得Dectin-1的細(xì)胞外區(qū)域

5、，將其連接到原核表達(dá)載體pET28a（+）中，獲得重組質(zhì)粒pET28-Dectin-1；再通過(guò)菌落PCR挑選陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和DNA測(cè)序鑒定；結(jié)果顯示：重組質(zhì)粒pET28-Dectin-1測(cè)序結(jié)果與GenBank相應(yīng)序列（登錄號(hào)AF262985）完全吻合，且插入片段讀碼框與表達(dá)載體讀碼框相一致。說(shuō)明含有Dectin-1基因CRD片段的pET28-Dectin-1重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 （二）小鼠Dectin-1融合蛋白的

6、表達(dá)、純化、復(fù)性與鑒定：將pET28-Dectin-1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）表達(dá)菌感受態(tài)細(xì)胞中，并以空質(zhì)粒pET28a（+）及未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的E.coli BL21（DE3）為對(duì)照，在不同的溫度和時(shí)間條件下加入IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE確定融合蛋白表達(dá)的最佳條件和形式。研究結(jié)果顯示：重組質(zhì)粒工程菌表達(dá)蛋白于23KD處檢測(cè)出特異性陽(yáng)性信號(hào)，即小鼠Dectin-1融合蛋白，且該融合蛋白在包涵體中表達(dá)量明顯高于上

7、清可溶性蛋白。結(jié)果提示：pET28-Dectin-1重組質(zhì)粒在E.Coil BL21表達(dá)系統(tǒng)中大量表達(dá)小鼠Dectin-1融合蛋白，該融合蛋白主要以包涵體形式存在。收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后包涵體蛋白，經(jīng)溶解、純化、復(fù)性，即獲得可溶性Dectin-1融合蛋白。
　　 （三）小鼠Dectin-1融合蛋白體外識(shí)別常見(jiàn)真菌細(xì)胞壁β-葡聚糖的初步研究：采用免疫熒光顯微鏡技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Dectin-1融合蛋白體外結(jié)合白假絲酵母菌、光滑