飛燕草素葡萄糖苷在血管內(nèi)皮細(xì)胞的攝取利用及損傷保護效應(yīng)研究.pdf

1、動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)及其導(dǎo)致的心腦血管疾病已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類生命和健康的一類主要疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，AS是導(dǎo)致西方發(fā)達國家居民死亡的主要病因，而其在我國的發(fā)病率也在逐年上升。AS發(fā)生是一個多因素導(dǎo)致的復(fù)雜過程，其中Ross提出的氧化損傷-炎性反應(yīng)學(xué)說被認(rèn)為是AS發(fā)病機制中最重要的假說。該假說認(rèn)為，血漿中氧化低密度脂蛋白(oxidizedlowdensitylipoprotein，oxLDL)引起的

2、內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷是AS發(fā)生的始動環(huán)節(jié)。oxLDL可誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激、內(nèi)皮依賴的血管舒張功能下降、血栓形成以及炎癥反應(yīng)，進而導(dǎo)致血管AS病變。近幾十年來，越來越多的研究表明，AS的發(fā)生與不健康的生活方式，特別是不合理的膳食習(xí)慣密切相關(guān)，世界衛(wèi)生組織的資料表明近50％的AS可通過改善飲食等生活方式來加以預(yù)防，提示研究如何通過膳食途徑有效預(yù)防AS具有十分重要的理論和現(xiàn)實意義。流行病學(xué)調(diào)查表明，蔬菜、水果等植物性食物的攝入可顯著降低AS及冠

3、心病的發(fā)病率，提示植物性食物中含有能預(yù)防AS發(fā)生的有效成分。進一步研究發(fā)現(xiàn)類黃酮化合物(flavonoids)是植物性食物中一類重要的預(yù)防AS的生物活性成分。類黃酮化合物屬于天然植物化學(xué)物(phytochemicals)中的多酚類化合物，種類繁多，因其結(jié)構(gòu)不同分為六類:黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、黃烷醇、異黃酮和花色苷，其中花色苷是植物中存在的天然色素，廣泛存在于各類有色水果和蔬菜中。人群干預(yù)研究結(jié)果顯示，每天攝入600mg花色苷，能夠顯著

4、增加血漿總抗氧化度，減少血管炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，從而降低AS和冠心病的發(fā)病率。然而，花色苷抗AS作用的相關(guān)機制尚未完全闡明。一方面，體內(nèi)代謝和生物利用的研究發(fā)現(xiàn)，花色苷吸收后體內(nèi)清除速率快、半衰期短，導(dǎo)致其生物利用率很低，這與花色苷顯著的心血管保護效應(yīng)形成了明顯的反差，提示其中可能存在血管內(nèi)皮或血管壁組織對花色苷的有效攝取和組織靶向分布。另一方面，近期研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。適度的自噬能通過降解細(xì)胞內(nèi)

5、氧化損傷物質(zhì)，尤其是線粒體，保護內(nèi)皮細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激的損傷，從而抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展?；ㄉ帐欠衲軌蛲ㄟ^誘導(dǎo)細(xì)胞自噬抑制內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷，以及相關(guān)作用機制如何，還有待進一步研究。
　　本實驗室前期對21種膳食中常見的花色苷化合物進行了藥效學(xué)篩選實驗，篩選出了抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷效應(yīng)最顯著的花色苷化合物——飛燕草素葡萄糖苷(delphinidin-3-glucoside，Dp)。本課題旨在前期工作的基礎(chǔ)上，深入研究飛燕

6、草素葡萄糖苷在血管內(nèi)皮細(xì)胞的攝取利用及抑制內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷效應(yīng)的分子機制。我們首先在動物實驗和原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)實驗中，利用Dp的自發(fā)熒光特性，采用高效液相色譜(HLPC)、激光共聚焦掃描顯微鏡等方法，研究了Dp在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的跨膜轉(zhuǎn)運、定位分布以及動脈血管壁組織吸收特征，并發(fā)現(xiàn)鈉依賴性葡萄糖轉(zhuǎn)運體(sodiumdependentglucosetransporter1，SGLT1)在Dp跨膜轉(zhuǎn)運中發(fā)揮重要作用;

7、然后通過構(gòu)建oxLDL誘導(dǎo)的HUVECs氧化應(yīng)激損傷體外細(xì)胞模型，觀察Dp對HUVECs活力、凋亡、自由基水平、及線粒體功能障礙、線粒體凋亡相關(guān)蛋白表達的影響;最后，我們利用電子顯微鏡、激光共聚焦掃描顯微鏡、siRNA、Westernblot等方法及特異性抑制劑，探討了Dp對內(nèi)皮細(xì)胞自噬的影響以及AMPK/SIRT1/自噬信號通路在Dp抑制內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷機制中的作用機制。
　　實驗結(jié)果:
　　(1)利用Dp的自發(fā)熒光特

8、性，研究結(jié)果顯示，Dp可被內(nèi)皮細(xì)胞攝取并在細(xì)胞中以原型形式存在，主要分布在內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞膜;小鼠尾靜脈注射Dp后發(fā)現(xiàn)Dp持續(xù)存在血管壁分布。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞存在SGLT1的細(xì)胞膜表達，沉默SGLT1后HUVECs對Dp的攝取被顯著阻斷，提示HUVECs對Dp的攝取利用至少部分是依賴SGLT1實現(xiàn)的。
　　(2)利用oxLDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷體外模型，研究結(jié)果表明，Dp能顯著抑制oxLDL導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)

9、胞凋亡，并增加細(xì)胞活力。對線粒體功能障礙的研究表明，Dp能顯著抑制oxLDL誘導(dǎo)的ROS和O2-等自由基增加，線粒體膜電位(△Ψ)降低及線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)持續(xù)開放，結(jié)果提示:Dp能抑制oxLDL導(dǎo)致的細(xì)胞線粒體功能障礙。通過siRNA沉默SGLT1受體并進而抑制Dp被內(nèi)皮細(xì)胞攝取，結(jié)果表明，oxLDL誘導(dǎo)的凋亡因子AIF、CytC、Bax、Caspase-3表達增加，抗凋亡因子Bcl-2表達降低，實驗結(jié)果表明，Dp能顯著抑

10、制oxLDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。
　　(3)Dp預(yù)處理可劑量依賴性的提高oxLDL處理的內(nèi)皮細(xì)胞自噬水平，增強內(nèi)皮細(xì)胞對氧化應(yīng)激的保護性反應(yīng);利用自噬抑制劑可顯著削弱Dp對oxLDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的抑制作用，提示:Dp可通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬抑制內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。進一步研究發(fā)現(xiàn)Dp能顯著上調(diào)AMPK和SIRT1的表達水平，采用AMPK和SIRT1的siRNA和特異性抑制劑能顯著降低Dp誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。研究表明:Dp可能通