原花青素對脂多糖引起的人血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用.pdf

1、目的： 動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）嚴(yán)重威脅人類健康，是發(fā)達(dá)國家人口死亡的主要原因，在我國AS的發(fā)病率也呈逐年增高的趨勢。血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cell，VEC）的損傷及功能障礙被認(rèn)為是As形成的開始。內(nèi)毒素是動(dòng)脈粥樣硬化的誘因之一。它是革蘭陰性菌細(xì)胞壁外膜的結(jié)構(gòu)成分之一，其化學(xué)本質(zhì)為脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）。不同種屬的G—桿菌具有相同的LP

2、S基本骨架，即由O特異性多糖、非特異性核心多糖和脂質(zhì)A（lipid A）三部分組成，其中脂質(zhì)A為其毒性中心。血管內(nèi)皮細(xì)胞是內(nèi)毒素以及眾多細(xì)胞因子作用的主要靶細(xì)胞，脂多糖通常通過直接或間接兩條途徑作用于血管內(nèi)皮，造成細(xì)胞的過強(qiáng)反應(yīng)，細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)和功能改變。直接損傷是脂多糖通過促使單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞等與血管內(nèi)皮細(xì)胞相結(jié)合，通過釋放蛋白酶及氧自由基直接損傷VEC。脂多糖亦可通過體液免疫反應(yīng)間接損傷VEC，加速了AS的發(fā)生與發(fā)展。

3、 原花青素（Proanthocyanidins，PC）是一類在植物中廣泛存在的多酚化合物，是存在于植物體內(nèi)的天然抗氧化物。原花青素具有多種生物活性、藥理作用和臨床療效，如極強(qiáng)的抗氧化活性，清除氧自由基、抗非酶糖基化、內(nèi)皮依賴性血管舒張活性、抗缺血再灌注損傷、抗炎、抗血小板聚集、免疫調(diào)節(jié)等。原花青素可對多種蛋白酶有強(qiáng)大的抑制作用，即可通過酶抑制活性保護(hù)血管。葡萄籽原花青素提取物（grape seed pmanthoeyanidin

4、 extract，GSPE）目前研究最多，其中原花青素含量可高達(dá)95％。 本實(shí)驗(yàn)在脂多糖刺激VEC中，加以原花青素的干預(yù)。檢測原花青素能否抑制脂多糖引起的細(xì)胞凋亡，以及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化。這可為開發(fā)干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抗As新藥提供一條新思路。 方法： 1．人血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)人血管內(nèi)皮細(xì)胞并鑒定，待細(xì)胞呈亞單層狀態(tài)，按常規(guī)方法進(jìn)行傳代，取生長狀態(tài)好的單層內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 2．實(shí)驗(yàn)分

5、為四組： ①對照組：用含10％血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)VEC細(xì)胞。 ②LPS組：含10％血清的培養(yǎng)基中加入LPS，使其濃度為含1ug/ml，培養(yǎng)VEC。 ③LPS+低濃度原花青素（PC）組：含10％血清的培養(yǎng)基中加入LPS和PC共同作用VEC細(xì)胞，LPS的最終濃度是1ug/ml，低濃度PC的最終濃度是10mg/ml，培養(yǎng)VEC。 ④LPS+高濃度原花青素（PC）組：含10％血清的培養(yǎng)基中加入LPS和PC共

6、同作用VEC細(xì)胞，LPS的最終濃度是1ug/ml，高濃度PC的最終濃度是20mg/ml，培養(yǎng)VEC。 將上述處理的細(xì)胞，置37℃5％CO2孵箱，繼續(xù)培養(yǎng)24h。 3．采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法檢測原花青素對脂多糖損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性的影響。用酶標(biāo)儀測定每孔光密度值，測定波長為490nm，計(jì)算細(xì)胞增殖率。（細(xì)胞增殖率=（處理組OD值－空白組OD值）/空白組OD值×100％）。 4．用Annexin—v

7、/PI法處理各組細(xì)胞，并使用流式細(xì)胞儀定量檢測各組細(xì)胞的凋亡率。 5．用Trizol提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Caspase3 mRNA的表達(dá)情況，通過測定循環(huán)閾值（Ct）顯示Caspase3 mRNA的表達(dá)量，以β－action作為參照，基因表達(dá)的相對變化以RQ值表示。 6．用Trizol提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測BCL－2 mRNA、BAX

8、mRNA的表達(dá)情況，通過測定循環(huán)閾值（Ct）顯示BCL－2mRNA、BAX mRNA的表達(dá)量，以β—action作為參照，基因表達(dá)的相對變化以RQ值表示。 結(jié)果： 1．免疫組織化學(xué)證實(shí)人血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)成功； 2．MTT的結(jié)果顯示：脂多糖明顯地減弱了血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活性，而再加入低，高兩種濃度的原花青素干預(yù)后均可明顯地增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性。 3．流式結(jié)果顯示：脂多糖明顯地減弱了血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活性

9、，原花青素可以有效抑制脂多糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。 4．實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示：LPS可引起Caspase—3 mRNA表達(dá)上調(diào)．而用不同濃度原花青素干預(yù)脂多糖處理組后細(xì)胞Caspase—3 mRNA的表達(dá)呈現(xiàn)降低趨勢。 5．我們的研究顯示：1ug/ml脂多糖刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞24h后，其Bcl—2 mRNA的表達(dá)明顯降低，Bax mRNA的表達(dá)明顯升高，Bcl—2/Bax比值明顯下降，與對照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<

10、0．05）。而在10mg/ml和20mg/ml兩種不同濃度的原花青素干預(yù)脂多糖處理組后其Bcl—2 mRNA，Bax mRNA，Bcl—2/Bax比值的變化恰恰與LPS組的變化相反，與LPS組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．05）。 結(jié)論： 本研究表明，LPS通過調(diào)節(jié)線粒體凋亡通路上的關(guān)鍵蛋白Bcl—2和Bax表達(dá)，引起caspase—3表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致人血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。而原花青素干預(yù)后可反方向調(diào)節(jié)Bcl—2和Bax表達(dá)，引