原花青素對脂多糖引起的人血管內皮細胞損傷的保護作用.pdf

1、目的： 動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）嚴重威脅人類健康，是發(fā)達國家人口死亡的主要原因，在我國AS的發(fā)病率也呈逐年增高的趨勢。血管內皮細胞（vascular endothelial cell，VEC）的損傷及功能障礙被認為是As形成的開始。內毒素是動脈粥樣硬化的誘因之一。它是革蘭陰性菌細胞壁外膜的結構成分之一，其化學本質為脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）。不同種屬的G—桿菌具有相同的LP

2、S基本骨架，即由O特異性多糖、非特異性核心多糖和脂質A（lipid A）三部分組成，其中脂質A為其毒性中心。血管內皮細胞是內毒素以及眾多細胞因子作用的主要靶細胞，脂多糖通常通過直接或間接兩條途徑作用于血管內皮，造成細胞的過強反應，細胞出現(xiàn)形態(tài)和功能改變。直接損傷是脂多糖通過促使單核細胞、中性粒細胞及T淋巴細胞等與血管內皮細胞相結合，通過釋放蛋白酶及氧自由基直接損傷VEC。脂多糖亦可通過體液免疫反應間接損傷VEC，加速了AS的發(fā)生與發(fā)展。

3、 原花青素（Proanthocyanidins，PC）是一類在植物中廣泛存在的多酚化合物，是存在于植物體內的天然抗氧化物。原花青素具有多種生物活性、藥理作用和臨床療效，如極強的抗氧化活性，清除氧自由基、抗非酶糖基化、內皮依賴性血管舒張活性、抗缺血再灌注損傷、抗炎、抗血小板聚集、免疫調節(jié)等。原花青素可對多種蛋白酶有強大的抑制作用，即可通過酶抑制活性保護血管。葡萄籽原花青素提取物（grape seed pmanthoeyanidin

4、 extract，GSPE）目前研究最多，其中原花青素含量可高達95％。 本實驗在脂多糖刺激VEC中，加以原花青素的干預。檢測原花青素能否抑制脂多糖引起的細胞凋亡，以及凋亡相關基因的表達變化。這可為開發(fā)干預內皮細胞炎癥反應的抗As新藥提供一條新思路。 方法： 1．人血管內皮細胞培養(yǎng) 培養(yǎng)人血管內皮細胞并鑒定，待細胞呈亞單層狀態(tài)，按常規(guī)方法進行傳代，取生長狀態(tài)好的單層內皮細胞，進行實驗。 2．實驗分

5、為四組： ①對照組：用含10％血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)VEC細胞。 ②LPS組：含10％血清的培養(yǎng)基中加入LPS，使其濃度為含1ug/ml，培養(yǎng)VEC。 ③LPS+低濃度原花青素（PC）組：含10％血清的培養(yǎng)基中加入LPS和PC共同作用VEC細胞，LPS的最終濃度是1ug/ml，低濃度PC的最終濃度是10mg/ml，培養(yǎng)VEC。 ④LPS+高濃度原花青素（PC）組：含10％血清的培養(yǎng)基中加入LPS和PC共

6、同作用VEC細胞，LPS的最終濃度是1ug/ml，高濃度PC的最終濃度是20mg/ml，培養(yǎng)VEC。 將上述處理的細胞，置37℃5％CO2孵箱，繼續(xù)培養(yǎng)24h。 3．采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法檢測原花青素對脂多糖損傷的血管內皮細胞增殖活性的影響。用酶標儀測定每孔光密度值，測定波長為490nm，計算細胞增殖率。（細胞增殖率=（處理組OD值－空白組OD值）/空白組OD值×100％）。 4．用Annexin—v

7、/PI法處理各組細胞，并使用流式細胞儀定量檢測各組細胞的凋亡率。 5．用Trizol提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，應用實時熒光定量PCR檢測Caspase3 mRNA的表達情況，通過測定循環(huán)閾值（Ct）顯示Caspase3 mRNA的表達量，以β－action作為參照，基因表達的相對變化以RQ值表示。 6．用Trizol提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，應用實時熒光定量PCR檢測BCL－2 mRNA、BAX

8、mRNA的表達情況，通過測定循環(huán)閾值（Ct）顯示BCL－2mRNA、BAX mRNA的表達量，以β—action作為參照，基因表達的相對變化以RQ值表示。 結果： 1．免疫組織化學證實人血管內皮細胞培養(yǎng)成功； 2．MTT的結果顯示：脂多糖明顯地減弱了血管內皮細胞的增殖活性，而再加入低，高兩種濃度的原花青素干預后均可明顯地增強血管內皮細胞增殖活性。 3．流式結果顯示：脂多糖明顯地減弱了血管內皮細胞的增殖活性

9、，原花青素可以有效抑制脂多糖引起的內皮細胞的凋亡。 4．實時熒光定量PCR結果顯示：LPS可引起Caspase—3 mRNA表達上調．而用不同濃度原花青素干預脂多糖處理組后細胞Caspase—3 mRNA的表達呈現(xiàn)降低趨勢。 5．我們的研究顯示：1ug/ml脂多糖刺激血管內皮細胞24h后，其Bcl—2 mRNA的表達明顯降低，Bax mRNA的表達明顯升高，Bcl—2/Bax比值明顯下降，與對照組相比均有統(tǒng)計學意義（P<

10、0．05）。而在10mg/ml和20mg/ml兩種不同濃度的原花青素干預脂多糖處理組后其Bcl—2 mRNA，Bax mRNA，Bcl—2/Bax比值的變化恰恰與LPS組的變化相反，與LPS組比較均有統(tǒng)計學意義（P<0．05）。 結論： 本研究表明，LPS通過調節(jié)線粒體凋亡通路上的關鍵蛋白Bcl—2和Bax表達，引起caspase—3表達上調，導致人血管內皮細胞凋亡。而原花青素干預后可反方向調節(jié)Bcl—2和Bax表達，引