銀杏葉提取物對(duì)AFB1致大鼠肝癌抑制作用的研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　原發(fā)性肝癌(Primary hepatic carcinoma，PHC)是人類比較常見的一種惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率排第五，死亡率排第三。我國(guó)是原發(fā)性肝癌高發(fā)的國(guó)家，每年因原發(fā)性肝癌死亡的人數(shù)有23萬之多，占全部惡性腫瘤死亡率近20％，僅次于胃癌位居第二位，在江蘇啟東及廣西扶綏地區(qū)原發(fā)性肝癌的發(fā)病率尤其突出。原發(fā)性肝癌具有診治難、進(jìn)展快、預(yù)后差的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害著人們的健康，必須進(jìn)一步加強(qiáng)原發(fā)性肝癌的防治

2、研究。
　　流行病學(xué)及動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明，在我國(guó)和一些非洲國(guó)家，慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染和飲食中黃曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)污染是原發(fā)性肝癌高發(fā)人群的2個(gè)主要危險(xiǎn)因素。而且，這兩個(gè)因素之間能夠相互協(xié)同，共同促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。AFT是由黃曲霉菌和寄生曲霉菌所產(chǎn)生的一種代謝產(chǎn)物，化學(xué)上屬二呋喃香豆素的衍生物。根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)的不同，天然產(chǎn)生的AFT分為B1、B2、G1及G2四種異構(gòu)體。在我國(guó)，許多的食物、糧油、藥品

3、原料、農(nóng)副產(chǎn)品及其制成品均易被AFT所污染，其中又以黃曲霉素B1(Aflatoxin B1，AFB1)的污染最為廣泛，毒理作用也最強(qiáng)。AFB1是目前所知的最強(qiáng)致癌物質(zhì)之一。研究表明，食物中黃曲霉毒素的含量多少與肝癌的發(fā)生呈正相關(guān)，這已被許多流行病學(xué)實(shí)驗(yàn)病理學(xué)研究所證實(shí)。
　　研究表明，AFB1在沒有經(jīng)過代謝活化之前的母體化合物是無致癌性的，它進(jìn)入機(jī)體后必須通過體內(nèi)的Ⅰ相藥物代謝酶細(xì)胞色素P450系統(tǒng)作用，生物代謝活化后才能表現(xiàn)出毒

4、性作用，被吸收的AFB1進(jìn)入機(jī)體后，經(jīng)Ⅰ相藥物代謝酶代謝轉(zhuǎn)化，形成黃曲霉毒素M1(Aflatoxin M1，AFM1)、黃曲霉毒素P1(Aflatoxin P1，AFP1)、黃曲霉毒素Q1(Aflatoxin Q1，AFQ1)及黃曲霉毒素醇，后三者被認(rèn)為無活性而通過尿液或糞便排泄出體外。而AFM1和AFB1可被細(xì)胞色素P4501A2(Microsomal cytochrome P4501A2，CYP1A2)、細(xì)胞色素P4503A4(Mi

5、crosomal cytochrome P4503A4，CYP3A4)代謝活化為能與細(xì)胞大分子物質(zhì)（DNA或蛋白）結(jié)合形成活性中間體AFM1-8，9環(huán)氧化物(AFM1-exo-8，9-epoxide)及AFB1-8，9環(huán)氧化物（AFB1-exo-8，9-epoxide，AFBO）方才具有基因毒性及致癌性。作為催化這一代謝反應(yīng)的關(guān)鍵酶——細(xì)胞色素P450，主要存在于肝細(xì)胞內(nèi)，其中又以CYP3A4的含量最多及活性最高。AFBO能自發(fā)和核酸及

6、蛋白質(zhì)等生物大分子相結(jié)合而形成相應(yīng)加合物。AFB1和DNA共價(jià)結(jié)合形成AFB1-DNA加合物是引起基因突變的基礎(chǔ)，也是導(dǎo)致原發(fā)性肝癌發(fā)生的第一步。AFB1-DNA加合物主要存在于肝細(xì)胞內(nèi)，除部分被體內(nèi)Ⅱ相代謝酶如谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶(GST)等作用下轉(zhuǎn)為無毒物排出體外，由于分子內(nèi)電子場(chǎng)的改變，也可自發(fā)形成其它DNA加合物，導(dǎo)致DNA損傷。
　　AFT嚴(yán)重危害著人類的健康，為了防止或者減少其造成的各種危害，除了避免食物被污染及去除毒素等措

7、施外，用各種化學(xué)的方法抑制、延遲或者逆轉(zhuǎn)癌變過程，并防止癌癥發(fā)生的途徑也日益被人們所重視。研究發(fā)現(xiàn)，一些植物性化學(xué)物如葉綠素、茶多酚、黃酮類化合物等在腫瘤化學(xué)預(yù)防這一鄰域有著獨(dú)特的防癌作用。通過在AFT高污染地區(qū)補(bǔ)充植物化學(xué)物制劑或其含量較高的食物來預(yù)防AFT致肝癌效應(yīng)的作用越來越受到眾多學(xué)者的重視。食物及其成分作為化學(xué)預(yù)防劑具有安全、易接受的優(yōu)點(diǎn)，是目前開展AFB1相關(guān)惡性腫瘤化學(xué)預(yù)防劑的重點(diǎn)研究領(lǐng)域之一。
　　銀杏(Ginko

8、go biloba L)為銀杏科植物，其葉和果均具有重要的藥用價(jià)值。標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉提取物(Ginkgo Biloba Extract)被國(guó)際通稱為EGb761，一般含有24％的黃酮甙類及5～7％的銀杏特有的萜烯類。近來研究發(fā)現(xiàn)EGb761及其組分可以通過抗氧化、抗血管生成及其基因調(diào)節(jié)而具有抗癌的作用。因此，目前對(duì)銀杏葉的藥用價(jià)值研究已從最初在心、腦血管系統(tǒng)疾病的應(yīng)用擴(kuò)展至抗腫瘤領(lǐng)域。前期實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)EGb761對(duì)AFB1誘導(dǎo)的大鼠肝癌有抑制

9、作用，但其具體作用機(jī)制尚未完全明確。研究發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)大鼠肝癌表達(dá)的眾多基因中，IGF-Ⅱ、p16Ink4a、NADE、GST-Pi及UGT等腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)明顯大于正常肝臟，p75NTR、P53、AKR7A及COX-2等基因與大鼠肝癌的關(guān)系尤為突出。本研究通過動(dòng)態(tài)觀察EGb761在AFB1誘發(fā)大鼠肝癌實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)肝臟相關(guān)代謝酶及上述腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討EGb761化學(xué)阻斷大鼠肝癌發(fā)生發(fā)展中的分子生物學(xué)機(jī)制。為肝癌防治藥物的

10、研制提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，將有很大的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)效益。
　　方法
　　建立AFB1致PHC大鼠模型:70只雄性4周齡Wistar大鼠適應(yīng)環(huán)境后，按體重隨機(jī)將其分為3組:AFB1組，25只，喂飼正常飼料，于第4周開始腹腔注AFB1至第52周;EGb761+AFB1組，25只，每天喂飼含2g/kgEGb761飼料至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，腹腔注AFB1劑量及時(shí)間同AFB1組;空白對(duì)照組，20只，喂飼正常飼料，不給AFB1處理。分別于實(shí)驗(yàn)第13周、

11、23周、33周、43周、53周及63周對(duì)全部動(dòng)物進(jìn)行剖腹肝活檢，第73周結(jié)束實(shí)驗(yàn)，處死全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。所取肝組織標(biāo)本分成3塊，一塊立即制備肝勻漿，分離出肝微粒體進(jìn)行肝代謝酶CYP3A4及GSH的檢測(cè);一塊冷凍保存于-80℃，用于檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)情況;一塊放入10％中性福爾馬林溶液內(nèi)固定后常規(guī)石蠟包埋，用于HE染色。采用Real time-PCR及WesternBlotting技術(shù)相對(duì)定量分析IGF-Ⅱ、p16Ink4a、NADE及p

12、75NTR等腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)情況，并對(duì)各蛋白表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果
　　1.大鼠腫瘤發(fā)生情況:
　　第73周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組有效動(dòng)物數(shù)及腫瘤發(fā)生情況如下:AFB1組17只，發(fā)生惡性腫瘤13例(76.5％)，其中10例為肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)，其余為膽管細(xì)胞癌2例、纖維肉瘤1例，原發(fā)性肝癌發(fā)生率為70.6％(12/17); EGb761+ AFB1組17只，發(fā)

13、生惡性腫瘤6例(35.3％)，其中HCC為5例，膽管細(xì)胞癌1例，原發(fā)性肝癌發(fā)生率為35.3％(6/17)。對(duì)照組16只，無腫瘤發(fā)生;EGb761+AFB1組肝癌發(fā)生率顯著低于AFB1組(P＜0.01)。
　　2.大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)變化情況
　　實(shí)驗(yàn)過程中，由AFB1誘發(fā)的肝臟惡性腫瘤最早出現(xiàn)在第52周，為纖維肉瘤，第一例肝癌的出現(xiàn)在第55周，最早出現(xiàn)腫瘤及第一例肝癌的大鼠均為AFB1組大鼠。鏡下動(dòng)態(tài)觀察肝活檢組織病理切片顯示

14、AFB1誘發(fā)大鼠肝癌的癌變過程大致可以分為三個(gè)階段，第一階段（13周～33周），出現(xiàn)不同程度的肝細(xì)胞變性;第二階段（34周～53周）出現(xiàn)異常肝細(xì)胞增生灶及增生結(jié)節(jié)，主要為嗜堿性結(jié)節(jié);第三階段（54周～73周）肝病變進(jìn)一步加重，逐漸可見癌結(jié)節(jié)。EGb761+ AFB1組大鼠在誘癌各階段的肝臟損害均較同時(shí)段AFB1組要輕，發(fā)生增生性病變比AFB1組亦較遲，對(duì)照組無上述改變。
　　3.EGb761對(duì)肝藥酶的影響
　　3.1大鼠肝組

15、織代謝酶CYP3A4活性的變化情況
　　在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，各組大鼠肝組織代謝酶CYP3A4活性在第23周及53周時(shí)呈現(xiàn)雙波峰變化;CYP3A4酶活性在AFB1組、EGb761+ AFB1組，除第13周外，其他時(shí)段均高于對(duì)照組;AFB1組在第53周及63周時(shí)CYP3A4的活性顯著于高于EGb761+ AFB1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3.2大鼠肝組織GSH含量的變化情況
　　在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，AFB1組

16、和EGb761+AFB1組肝組織GSH含量在第13至33周時(shí)較正常對(duì)照組要低，隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展，呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，但AFB1組下降過程明顯要快于EGb761+AFB1組，在第43周及53周時(shí)差異最明顯(P＜0.05）。而正常對(duì)照組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中各時(shí)段韻變化并不明顯。
　　4.EGb761對(duì)大鼠肝癌發(fā)生過程中腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　4.1 EGb761對(duì)大鼠肝組織p16Ink4a mRNA及相應(yīng)蛋白表達(dá)的影響
　　在

17、第13周、33周時(shí)，各組p16Ink4a mRNA的表達(dá)量差異不明顯(P＞0.05)。至第53、73周時(shí)，AFB1組、EGb761+AFB1組p16Ink4a mRNA的表達(dá)量均較對(duì)照組下調(diào)（P＜0.05），AFB1組下調(diào)最明顯，與EGb761+AFB1組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　在第13周、33周時(shí)，p16Ink4a蛋白在各組的表達(dá)水平無明顯差異(P＞0.05)。至第53周、73周時(shí)，AFB1組和EGb761+

18、AFB1組中表達(dá)量較對(duì)照組均有所下調(diào)(P＜0.05）。p16Ink4a蛋白在EGb761+AFB1組表達(dá)水平較同時(shí)段AFB1組要高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4.2 EGb761對(duì)大鼠肝組織P53 mRNA表達(dá)的影響
　　P53 mRNA的表達(dá)量于第13周時(shí)在各組大鼠肝組織中均有低度表達(dá)，差異不明顯;至第33、53及73周時(shí)，AFB1組、EGb761+AFB1組的表達(dá)量均較對(duì)照組上調(diào)(P＜0.01);但P53

19、mRNA在EGb761+AFB1組的表達(dá)量較同時(shí)段AFB1組要高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　4.3 EGb761對(duì)大鼠肝組織IGF-Ⅱ mRNA及蛋白表達(dá)的影響
　　第13周、33周時(shí)，IGF-Ⅱ mRNA在各組肝組織中均有表達(dá)，但無明顯差異(P＞0.05);至第53周、73周時(shí)，與對(duì)照組比較，AFB1組和EGb761+AFB1組中IGF-Ⅱ mRNA的表達(dá)均明顯上調(diào)(P＜0.01);EGb761+AFB1組中

20、IGF-Ⅱ mRNA表達(dá)水平較同時(shí)段AFB1組明顯要低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　第13周、33周時(shí)，IGF-Ⅱ蛋白在各組肝組織中均為低表達(dá)或幾乎不表達(dá)，無明顯差異;至第53周、73周時(shí)，IGF-Ⅱ蛋白在AFB1組和EGb761+AFB1組均為高表達(dá)，明顯高于對(duì)照組;且隨肝癌的發(fā)生發(fā)展有逐漸增高趨勢(shì);第53周、73周時(shí)，EGb761+AFB1組IGF-Ⅱ蛋白表達(dá)水平始終低于同期AFB1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.0

21、1)。
　　4.4 EGb761對(duì)大鼠肝組織NADE mRNA及蛋白表達(dá)的影響
　　自第33周開始，NADE mRNA的表達(dá)量在AFB1組和EGb761+AFB1組均較同時(shí)段正常對(duì)照組要高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，兩組間差異不明顯（P＞0.05）。
　　第33、53及73周時(shí)，AFB1、EGb761+AFB1兩組中NADE蛋白的表達(dá)量均較正常對(duì)照組明顯要高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);兩組間比較，EGb

22、761+AFB1組表達(dá)較AFB1組要高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.5 EGb761對(duì)大鼠肝組織p75NTR mRNA及蛋白表達(dá)的影響
　　在實(shí)驗(yàn)開始的第13至第33周，各組的p75NTR mRNA表達(dá)量差異不明顯。到第53周及第73周時(shí)，在AFB1組及EGb761+AFB1組中的p75NTRmRNA表達(dá)量較正常對(duì)照組明顯下調(diào)(P＜0.05);其中AFB1組下調(diào)更為明顯，與EGb761+AFB1組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

23、＜0.01）。
　　實(shí)驗(yàn)至第53周時(shí)開始，p75NTR蛋白在AFB1組及EGb761+AFB1組中的表達(dá)量較正常對(duì)照組明顯下降(P＜0.01); AFB1組p75NTR蛋白表達(dá)量較EGb761+AFB1組要低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.6 EGb761對(duì)大鼠肝組織COX-2 mRNA表達(dá)的影響
　　在實(shí)驗(yàn)開始的第13及33周時(shí)，COX-2 mRNA在AFB1組、EGb761+AFB1組均呈低表達(dá)狀態(tài)，

24、差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;至第53周及73周時(shí)COX-2 mRNA在AFB1組及EGb761+AFB1組均呈高表達(dá)量狀態(tài)，與正常對(duì)照組比較差異明顯（P＜0.01）;而兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;空白對(duì)照組的COX-2 mRNA在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，都呈低表達(dá)甚至無表達(dá)狀態(tài)。
　　4.7 EGb761對(duì)大鼠肝組織UGT mRNA表達(dá)的影響
　　在實(shí)驗(yàn)過程中的第13、33、53及73周時(shí)，UGT mRNA在AFB1組及EGb

25、761+AFB1組中表達(dá)量均較正常對(duì)照組明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);其中UGT在EGb761+AFB1組中的表達(dá)量在各時(shí)段較AFB1組顯著要高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　4.8 EGb761對(duì)大鼠肝組織AKR7A mRNA表達(dá)的影響
　　在實(shí)驗(yàn)開始的第13周，AKR7A mRNA的表達(dá)量在AFB1組及EGb761+AFB1組中較正常對(duì)照組均要明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);第33、5

26、3周及73周，EGb761+AFB1組中的表達(dá)量要高于AFB1組(P＜0.01)。
　　4.9 EGb761對(duì)大鼠肝組織GST-Pi mRNA表達(dá)的影響
　　在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，GST-Pi mRNA的表達(dá)量在AFB1組及EGb761+AFB1組中較正常對(duì)照組均要明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);至第33、53周時(shí)，AFB1組的表達(dá)量要高于EGb761+AFB1組，但無顯著性差異(P＞0.05);至第73周，AFB1

27、組的表達(dá)量要顯著高于EGb761+AFB1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　5.0p16Ink4a、IGF-Ⅱ、NADE及P75NTR蛋白表達(dá)的相互關(guān)系
　　在實(shí)驗(yàn)第73周、53周及33周時(shí)，AFB1組及EGb761+AFB1組中p16Ink4a蛋白的表達(dá)與p75NTR蛋白的表達(dá)呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)。
　　結(jié)論
　　1.銀杏葉提取物能有效降低AFB1誘發(fā)肝癌的發(fā)生率，具有防癌作用，可成為人

28、類與AFB1相關(guān)性肝癌的化學(xué)預(yù)防劑。
　　2.在AFB1誘發(fā)大鼠肝癌過程中，銀杏葉提取物能抑制肝臟Ⅰ相酶CYP3A4的活性，從而減少具有基因毒性及致癌性的AFBO的形成，降低其致癌性。
　　3.銀杏葉提取物能提高大鼠肝臟GSH的含量水平，從而提高機(jī)體的抗氧化能力，減輕AFB1誘癌過程中自由基所致的脂質(zhì)過氧化損傷，亦可能是其發(fā)揮抗癌作用的機(jī)制之一。
　　4.銀杏葉提取物在AFB1誘發(fā)大鼠肝癌過程中，能夠上調(diào)抑癌基因p16

29、Ink4a、P53及p75NTR的表達(dá)水平，下調(diào)肝癌病變相關(guān)增殖基因 IGF-Ⅱ的表達(dá)量，可能是其抗癌作用的分子生物學(xué)基礎(chǔ)之一。
　　5.銀杏葉提取物在AFB1誘發(fā)的大鼠肝癌病變過程中，可以顯著提高肝組織相關(guān)解毒代謝酶UGT及AKR7A的表達(dá)水平，以增強(qiáng)機(jī)體自身對(duì)真菌毒素的解毒能力。
　　6.銀杏葉提取物在AFB1誘發(fā)的大鼠肝癌病變過程中，能夠下調(diào)GST-Pi的表達(dá)水平，可能與GST-Pi啟動(dòng)子區(qū)的甲基化現(xiàn)象有關(guān)。