抑制性受體ILTs及其配體的胃癌表達的實驗和臨床研究.pdf

1、研究背景：胃癌是嚴重危害人類健康的惡性疾病，全球每年有超過93萬新發(fā)的胃癌病例，胃癌死亡率約為29.34/10萬(男性40.80/10萬，女性18.60/10萬)，是世界范圍高居第二位的癌癥死亡原因。據(jù)衛(wèi)生部疾控司2006年統(tǒng)計，我國每年新發(fā)胃癌患者約40萬人，因胃癌死亡患者約30萬人，患病率和死亡率超過世界平均水平的兩倍。近年來，國內(nèi)外學者對胃癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移進行了大量的基礎(chǔ)和臨床研究，取得了部分成果。但在胃癌的發(fā)病機制、早期診斷、干預

2、治療和預后判斷方面，仍處于積極的探索階段。因此深入研究胃癌的發(fā)病機制，探討胃癌發(fā)病過程中腫瘤和免疫細胞的功能及狀態(tài)，對研究胃癌及干預治療無疑具有重要的指導意義。
　　 胃癌的病因目前仍不十分清晰。流行病學研究發(fā)現(xiàn)，胃癌的發(fā)病與飲食因素、感染因素、遺傳因素及其他環(huán)境因素有關(guān)。近年最新的研究認為，胃癌的發(fā)生發(fā)展是宿主免疫系統(tǒng)和胃癌細胞相互作用的結(jié)果，不僅涉及到宿主效應(yīng)細胞多種功能(T淋巴細胞數(shù)量和功能異常、活化障礙及凋亡增加)及細胞

3、因子(IFN-γ含量降低、IL-10含量升高等)的改變，還與胃癌細胞自身的異常(缺乏協(xié)同刺激分子、MHC表達降低或缺失、FasL高表達)及相關(guān)癌基因及抑癌基因異常密切相關(guān)。其中腫瘤細胞表面缺少共刺激分子的表達是免疫逃逸的主要原因。目前發(fā)現(xiàn)共刺激分子有兩種，即正性共刺激分子和負性共刺激分子。正性共刺激分子通過與淋巴細胞的受體結(jié)合共刺激免疫反應(yīng)，影響T細胞的活化、增殖及細胞因子分泌。而負性共刺激分子通過兩種方法來誘導T細胞無能：一是誘導抑制

4、因子表達在效應(yīng)性免疫細胞上，二是誘導抑制性因子受體表達在腫瘤細胞上。
　　 免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄子(Ig-like transcripts，ILTs)或白細胞抑制受體是最近發(fā)現(xiàn)的一類HLA-I受體家族，目前發(fā)現(xiàn)有九個家族成員，在T淋巴細胞、單個核細胞、NK細胞及樹突狀細胞表面廣泛表達。不同種類的ILTs通過傳導抑制性或刺激性信號發(fā)揮廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，在抑制免疫殺傷細胞的殺傷活性、調(diào)節(jié)樹突狀細胞與T細胞間的信號傳遞、參與樹突狀細胞的

5、抗原俘獲等方面具有重要的生物學意義。其中ILT2、ILT3、ILT4屬抑制性受體，其結(jié)構(gòu)共同特點是有一個長的膜內(nèi)段，含有3個免疫受體酪氨酸抑制基序，有4個或2個膜外的IgSF區(qū)。該類因子的功能主要是抑制分子，但其在腫瘤細胞上的表達和功能尚不清楚。
　　 HLA-G分子是一種非經(jīng)典HLA-I類抗原，該基因具有8個外顯子和7個內(nèi)含子。HLA-G分子在結(jié)構(gòu)上胞內(nèi)段很短，并且原始的HIA-G轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)選擇性剪切產(chǎn)生7種mRNA，編碼出7

6、種HLA-G蛋白異構(gòu)體。其中HLA-G1和HLA-G5可以高特異性結(jié)合ILT2、ILT4，且與ILT2、ILT4結(jié)合親和力比經(jīng)典HLA-I與ILT2、ILT4親和大3-4倍。HLA-G分子通過抑制免疫活性細胞的功能在免疫耐受的建立和維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用。HLA-G可通過與NK細胞、T細胞、APC等細胞表面的抑制性受體ILT-2、ILT-4等結(jié)合發(fā)揮抑制性免疫調(diào)節(jié)作用。可溶性HLA-G(sHLA-G)還可與CD8+細胞受體結(jié)合，誘導NK細胞

7、和T細胞的凋亡、抑制同種特異性T細胞的細胞周期進程。除此之外，研究顯示，HLA-G還可誘導調(diào)節(jié)性T細胞和抑制性NK細胞的產(chǎn)生，并可在很大程度上通過移植細胞顆粒極化來保護靶細胞不被NK細胞和T細胞殺傷。HLA-G分子除表達于胎盤絨毛膜細胞、腫瘤細胞外，還可少量表達在眾多組織細胞上，包括T淋巴細胞。而胃癌患者中淋巴細胞HLA-G表達變化如何?作為抑制性受體ILT2、ILT4等的主要配體，在不同分化程度胃癌發(fā)生過程中所起作用如何，目前尚不清晰

8、。
　　 研究目的和方法：
　　 一、本研究采用實時熒光定量PCR-Sybr Green I和FACS流式細胞術(shù)等方法對人的高分化胃癌細胞株(MKN1)、中分化胃癌細胞株(SGC-7901、AGS)、低分化胃癌細胞株(MGC803)和未分化分化胃癌細胞株(HGC-27、BCG823)中的mRNA和蛋白表達進行了檢測和分析，系統(tǒng)地探討了ILT2、ILT3和ILT4在不同分化程度的人胃癌細胞中的表達變化，為后期試驗和相關(guān)研究

9、提供了試驗依據(jù)。
　　 二、為了探討不同表達程度的抑制性受體ILTs對免疫細胞的影響，我們通過體外細胞試驗，將ILT2lowILT3lowILT4low胃癌細胞MKN1和ILT2highILT3highILT4high胃癌細胞HGC-27分別與PBMC和NK細胞共培養(yǎng)，通過檢測細胞殺傷活性(MTT)，CD4+、CD8+T淋巴細胞和NK細胞上HLA-G分子的表達改變探討抑制性受體ILTs對效應(yīng)細胞的調(diào)控作用。
　　 三、為

10、進一步探討抑制性受體ILT2、ILT3和ILT4在臨床應(yīng)用中的價值，采用免疫組織化學方法檢測了臨床不同分化程度胃癌患者病理組織中ILT2、ILT3和ILT4的表達，并探討了其與腫瘤生物學行為和臨床特征的關(guān)系。
　　 四、為了探討作為抑制性受體ILTs主要配體的HLA-G在臨床胃癌患者淋巴細胞中的表達變化，應(yīng)用TaqMan探針FQ-PCR和FACS流式細胞術(shù)對不同分化胃癌患者外周血淋巴細胞HLA-G mRNA和CD4+、CD8+T

11、淋巴細胞上HLA-G分子表達及其與臨床進程的關(guān)系進行了初步分析。
　　 以上研究通過體外細胞試驗和臨床應(yīng)用研究，系統(tǒng)的探討了抑制性受體ILT2、ILT3和ILT4在不同分化程度的胃癌細胞中的表達變化及其對效應(yīng)細胞的影響，期望為闡明胃癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子機制提供實驗依據(jù)，同時為臨床胃癌的診斷、防治和新藥開發(fā)尋找新的靶目標提供依據(jù)。
　　 結(jié)果及結(jié)論：
　　 一、胃癌細胞株抑制性受體ILTs mRNA和蛋白表達

12、　　 1.實時熒光定量PCR-Sybr Green I檢測結(jié)果表明，6株不同分化程度的人胃癌細胞均不同程度表達了ILT2、ILT3和ILT4 mRNA，尤以ILT2表達最強。其中在高分化的胃癌細胞株MKN1中ILT2、ILT3和ILT4 mRNA表達最低，未分化胃癌細胞株HGC-27和BCG823的mRNA表達最高，顯示隨分化程度存在顯著性差異。
　　 2.FACS流式細胞術(shù)檢測顯示，6株胃癌細胞中除一株未分化胃癌細胞BCG8

13、23表達ILT3、ILT4極低外，其余均檢測到ILT2、ILT3和ILT4不同程度的蛋白表達，且其表達程度與腫瘤細胞分化相關(guān)，尤以ILT2表現(xiàn)最明顯。
　　 上述實驗結(jié)果表明，通過某種共同信號途徑使惡性程度高的胃癌細胞高表達抑制性受體ILT2、ILT3和ILT4，并可能影響到效應(yīng)細胞的功能及對腫瘤的殺傷。
　　 二、抑制性受體ILTs對效應(yīng)細胞調(diào)控的實驗研究
　　 1.ILT2highILT3highILT4hi

14、gh胃癌細胞HGC-27與PBMC、NK細胞共培養(yǎng)后效應(yīng)細胞殺傷活性(MTT)較ILT2lowILT3lowILT4low胃癌細胞MKN1與PBMC、NK細胞共培養(yǎng)后效應(yīng)細胞殺傷活性顯著降低，初步表明胃癌細胞不同表達程度的ILT2、ILT3、ILT4影響PBMC、NK細胞的增殖和殺傷作用。
　　 2.ILT2highILT3highILT4high的HGC-27細胞和ILT2lowILT3lowILT4low的MKN1細胞分別與

15、PBMC和NK細胞共培養(yǎng)24h后，與各自對照相比，T細胞和NK細胞表面HLA-G的表達明顯變化，且ILT2highILT3highILT4high的HGC-27細胞對HLA-G的影響較ILT2lowILT3lowILT4low的MKN1細胞更明顯。其中T淋巴細胞HLA-G主要表達于CD4+T細胞，CD8+T細胞表達很低或基本不表達；CD56+NK細胞表達結(jié)果顯示同樣的趨勢，但總體表達水平較CD4+細胞低。
　　 實驗結(jié)果提示胃癌

16、細胞上ILT2、ILT3和ILT4分子表達對效應(yīng)細胞的殺傷活性有影響，并可能對HLA-G的表達有一定的調(diào)控作用。
　　 三、胃癌患者ILT表達的臨床應(yīng)用研究
　　 免疫組織化學分析顯示，50例不同組織類型、不同分化程度的胃癌患者病理組織中ILT2、ILT3和ILT4分子有不同程度的表達。在腫瘤細胞上的表達形式是散在的，可位于胃癌細胞膜或胞漿內(nèi)或兩者皆有，病灶周圍的基質(zhì)細胞也有部分表達。ILT2、ILT3和ILT4表達陽性

17、率在50例胃癌組織標本中差異較大。其中ILT2表達陽性率最高，為62.0％(31/50)，ILT3、ILT4表達陽性率分別為18.096(9/50)和34％(17/50)，正常胃組織中未見ITL2，ILT3，ILT4的表達。提示抑制性受體ILTs，尤其是ILT2有可能成為胃癌臨床診斷的有價值指標，并為胃癌臨床干預治療提供新的靶點。
　　 四、胃癌患者淋巴細胞非經(jīng)典HLA-G的表達
　　 1.通過TaqMan探針FQ-PC

18、R檢測發(fā)現(xiàn)，胃癌患者及健康對照淋巴細胞HLA-GmRNA總體表達水平較弱。其中，胃癌臨床分級Ⅰ+Ⅱ期的患者與健康對照相比相對表達量無顯著性差異(P>0.05)；臨床分級Ⅲ+Ⅳ期患者轉(zhuǎn)錄水平較Ⅰ+Ⅱ期相對表達量低(P<0.05)。而從臨床病理組織分化程度分析，分化良好型與低分化型胃癌患者HLA-G mRNA表達未見明顯改變。
　　 2.通過FACS流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，無論健康對照和胃癌患者，淋巴細胞HLA-G分子表達陽性率均較低。