siRNA干擾人胃癌細(xì)胞株SGC-7901 COX-2的表達(dá)抑制胃癌復(fù)發(fā)和肝轉(zhuǎn)移的臨床和實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分COX-2和Ki-67及MVD在胃癌組織中的表達(dá)及其與胃癌肝轉(zhuǎn)移及胃癌復(fù)發(fā)關(guān)系的研究 目的：研究胃癌組織中COX-2、Ki-67的表達(dá)和微血管密度(MVD)，探討與胃癌肝轉(zhuǎn)移和胃癌復(fù)發(fā)關(guān)系密切的臨床病理因素和免疫生化指標(biāo)，探索胃癌肝轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的規(guī)律，為胃癌治療和隨訪提供指導(dǎo)。 方法：回顧性分析手術(shù)切除的胃癌肝轉(zhuǎn)移病例31例和48例胃癌復(fù)發(fā)病例的病理特征，并任取48例無(wú)肝轉(zhuǎn)移、無(wú)復(fù)發(fā)病例作對(duì)照組。用免疫組織化學(xué)方法

2、檢測(cè)胃癌標(biāo)本中COX-2、Ki-67的表達(dá)和微血管密度(MVD)，并分析三者之間及其與臨床病理因素之間的相關(guān)性。用單因素和多因素分析研究影響胃癌肝轉(zhuǎn)移和胃癌復(fù)發(fā)的相關(guān)因素。 結(jié)果 (1)全組胃癌COX-2蛋白陽(yáng)性率為88.2％，肝轉(zhuǎn)移組、復(fù)發(fā)組和對(duì)照組分別為100％、85.4％和83.3％，而且肝轉(zhuǎn)移組、復(fù)發(fā)組和對(duì)照組強(qiáng)陽(yáng)性率分別為83.9％、52.1％和29.2％。 (2)COX-2、Ki-67LI和MVD相互

3、之間具有極強(qiáng)的相關(guān)性，并且三者都與腫瘤的浸潤(rùn)深度、TNM分期、肝轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和周圍臟器受累密切相關(guān)；COX-2和Ki-67LI都與存在腹水、腹膜侵犯和Borrmann分型高度相關(guān)；除此之外，COX-2還與盆腔轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)、腫瘤長(zhǎng)徑相關(guān)，MVD與胃癌復(fù)發(fā)相關(guān)，Ki-67LI與腫瘤長(zhǎng)徑、漿膜浸潤(rùn)情況和腫瘤細(xì)胞的分化程度都存在具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)性。 (3)胃癌病例有腹水存在、盆腔轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)形成、侵犯腹膜、腫瘤部位在胃體或全胃、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)

4、移、累及周圍臟器以及腫瘤TNM分期Ⅲ或Ⅳ期、浸潤(rùn)深度T4期、COX-2強(qiáng)陽(yáng)性、MVD增加者肝轉(zhuǎn)移明顯增加，是胃癌肝轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素；侵犯腹膜、盆腔轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)、TNM分期和MVD是胃癌肝轉(zhuǎn)移最重要的四個(gè)影響因素。浸潤(rùn)深度、盆腔轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)、COX-2蛋白強(qiáng)陽(yáng)性和MVD與胃癌復(fù)發(fā)密切相關(guān)，是胃癌復(fù)發(fā)的高危因素。 (4)對(duì)照組、復(fù)發(fā)組和肝轉(zhuǎn)移組胃癌生存率比較有極顯著差異，與對(duì)照組相比較，復(fù)發(fā)組和肝轉(zhuǎn)移組胃癌生存率明顯減低，均有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

5、差異。初發(fā)胃癌的浸潤(rùn)深度、盆腔轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)、存在腹水以及胃癌標(biāo)本中COX-2含量增高是胃癌術(shù)后生存率降低的危險(xiǎn)因素。 結(jié)論 (1)腹膜侵犯、盆腔轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)、TNM分期和MVD是影響胃癌肝轉(zhuǎn)移最重要的因素，浸潤(rùn)深度、盆腔轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)、COX-2蛋白強(qiáng)陽(yáng)性和MVD與胃癌復(fù)發(fā)密切相關(guān)，是胃癌復(fù)發(fā)的高危因素。 (2)COX-2與Ki-67LI和MVD相互之間具有極強(qiáng)的相關(guān)性，并且三者都與腫瘤的浸潤(rùn)深度、TNM分期、肝轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)

6、移和周圍臟器受累密切相關(guān)。 (3)COX-2、浸潤(rùn)深度、盆腔轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)和存在腹水是影響胃癌病人生存率的主要因素，與胃癌病人的預(yù)后有關(guān)。 (4)檢測(cè)臨床病理和生物化學(xué)指標(biāo)可能預(yù)測(cè)胃癌肝轉(zhuǎn)移和胃癌復(fù)發(fā)的發(fā)生，靶向于COX-2和微血管形成的治療可能提高胃癌病人的預(yù)后。 第二部分RNA干擾靶向抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞COX-2基因和蛋白表達(dá)方法的建立 目的：應(yīng)用特異、高效并且方法簡(jiǎn)單的RNAi技術(shù)，選擇在胃腸道

7、腫瘤中廣泛存在、與腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性(腫瘤細(xì)胞的增生、凋亡、侵襲和粘附)息息相關(guān)，影響胃癌的發(fā)生和發(fā)展的COX-2作為靶點(diǎn)，建立有效的RNA干擾方法。 方法購(gòu)置和培養(yǎng)高轉(zhuǎn)移性胃癌細(xì)胞株SGC7901細(xì)胞，對(duì)其COX-2基因進(jìn)行克隆、鑒定和測(cè)序，并與基因庫(kù)中COX-2基因進(jìn)行序列對(duì)比。根據(jù)所克隆COX-2基因用Sfold軟件設(shè)計(jì)了6條針對(duì)COX-2基因不同部位的siRNA，同時(shí)設(shè)計(jì)一條陰性對(duì)照siRNA，將選擇的序列和相應(yīng)的基因組

8、數(shù)據(jù)庫(kù)(人、小鼠、大鼠等)進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，確信所選擇的序列與其他的基因不具有同源性，并用化學(xué)方法合成。 結(jié)果 (1)測(cè)序結(jié)果表明：胃癌SGC7901細(xì)胞中克隆的COX2基因經(jīng)拼合后有1931bp，所克隆序列和genbank中COX-2標(biāo)準(zhǔn)序列(genebankNo.NM_000963)對(duì)比顯示：共6處7個(gè)堿基不同，沒(méi)有缺失和插入。 (2)lipofectamin2000和TOPtransfection介導(dǎo)

9、的pcDNA3.1/His/lacZ質(zhì)粒和pcDNA3.1/His/lacZ/siRNA可以有效的轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞，細(xì)胞轉(zhuǎn)染率分別達(dá)到56％和68％。lipofectamin2000和TOPtransfection介導(dǎo)的pcDNA3.1/His/lacZ質(zhì)粒和pcDNA3.1/His/lacZ/siRNA可以有效轉(zhuǎn)染胃癌SGC7901細(xì)胞，細(xì)胞轉(zhuǎn)染率分別達(dá)到49％和55％。因此選擇TOPtransfection介導(dǎo)COX-2-si

10、RNA，進(jìn)行靶向抑制胃癌SGC7901細(xì)胞COX-2表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究。 (3)COX-2(0-5)和陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染胃癌SGC7901細(xì)胞24hr后，測(cè)得COX-2mRNA拷貝數(shù)分別為3.5、4.75、11.53、6.45、17.08、12.33和209.1，與陰性對(duì)照相比，每條siRNA都有很好的基因敲除效果，最強(qiáng)干擾效果達(dá)98.3％，最低也在90％以上；COX-20-siRNA轉(zhuǎn)染胃癌7901細(xì)胞后24hr干擾效果最好，

11、與對(duì)照組相比，抑制COX-2mRNA表達(dá)96.9％，48hr和72hr抑制率分別為86.3％和41.9％；0.2ug、0.4ug和0.6ugCOX20-siRNA轉(zhuǎn)染胃癌7901細(xì)胞24hr后COX2mRNA表達(dá)的抑制率分別為96.9％、96.1％和97.6％；COX-20-siRNA轉(zhuǎn)染胃癌7901細(xì)胞后24hrCOX-2蛋白抑制率為71.5％。 結(jié)論 (1)本研究證實(shí)高轉(zhuǎn)移性胃癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞中能克隆出完

12、整的COX-2基因，其序列與文獻(xiàn)報(bào)道一致。 (2)TOPtransfection介導(dǎo)報(bào)告基因pcDNA3.1/His/lacZ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細(xì)胞和肝癌HepG2細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染報(bào)告基因siRNA(pcDNA3.1/His/lacZ/siRNA)對(duì)報(bào)告基因lacZ的抑制效果優(yōu)于lipofectamin2000。 (3)TOPtransfection介導(dǎo)的COX-2-siRNA能夠有效抑制胃癌SGC7901細(xì)胞中C

13、OX-2基因和蛋白的表達(dá)，這種抑制效果在轉(zhuǎn)染后24hr最強(qiáng)，隨著時(shí)間的推遲抑制效果減弱，但是不隨siRNA濃度的變化而波動(dòng)。 第三部分靶向COX-2的RNA干擾對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞和裸鼠皮下種植瘤生長(zhǎng)的抑制作用 目的：在建立有效的RNA干擾方法的基礎(chǔ)上，探討靶向COX-2的RNA干擾對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增生和凋亡的影響以及對(duì)裸鼠皮下種植瘤的抑制作用，建立胃癌及其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移基因治療的新方法。 方法COX

14、-20-siRNA和陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細(xì)胞后24hr，用熒光定量PCR和Westernblotting方法檢測(cè)細(xì)胞中COX2mRNA拷貝數(shù)和蛋白含量，同時(shí)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)胃癌細(xì)胞凋亡情況，并與未經(jīng)轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞做對(duì)比。同樣用三組細(xì)胞接種裸鼠皮下，8周后處死裸鼠，剝離瘤體，測(cè)量腫瘤體積、重量和抑瘤率；同時(shí)用熒光定量PCR和Westernblotting檢測(cè)皮下種植瘤中COX-2mRNA拷貝數(shù)以及COX-2和ki-6

15、7蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 (1)與對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組胃癌細(xì)胞有很好的基因敲除效果，干擾效果達(dá)到97.8％和97.7％；陰性對(duì)照組COX-2蛋白無(wú)明顯變化，實(shí)驗(yàn)組COX-2蛋白抑制率為70.9％。 (2)實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組及對(duì)照組胃癌細(xì)胞凋亡率分別為(n=8)：22.28±3.62、1.23±0.27和1.03±0.14。試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組(t=14.214，P=0.000)和對(duì)照組(t=14.378，P=

16、0.000)比較，均具有極顯著差異，陰性對(duì)照組與對(duì)照組比較(t=1.635，P=0.133)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (3)實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組及對(duì)照組裸小鼠皮下種植瘤平均體積1367.2±665.2、3011.4±966.8和3108.6±1006.3mm3，試驗(yàn)組、陰性對(duì)照組及對(duì)照組裸小鼠皮下種植瘤平均重量分別為1.24±0.86g、2.57±1.43g和2.66±1.65g，按體積和重量計(jì)算，與對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組裸小鼠皮

17、下種植瘤抑瘤率分別為56.0％和3.1％以及54.4％和3.4％。實(shí)驗(yàn)組COX-2mRNA表達(dá)明顯降低，有很好的基因敲除效果，與對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比干擾效果分別達(dá)到67.8％和66.4％。與對(duì)照組比較，陰性對(duì)照組COX-2蛋白和ki-67蛋白均無(wú)明顯變化，實(shí)驗(yàn)組COX-2蛋白和ki-67蛋白抑制率分別為56.7％和51.8％。 結(jié)論(1)靶向COX-2的RNA干擾能有效抑制胃癌SGC7901細(xì)胞中COX-2基因和蛋白表達(dá)。