黃藥子抑制胃癌生長轉(zhuǎn)移的實驗研究.pdf

1、胃癌是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，2008年全球新發(fā)胃癌患者近99萬例，占全部新發(fā)癌癥病例8％，死亡近74萬，占全部死亡病例10％。目前，在世界范圍內(nèi)GC占腫瘤死亡率的第2位，僅次于肺癌。流行病學調(diào)查統(tǒng)計，我國胃癌的發(fā)病率2000年居第三位，2004～2007年上升至第二位。2010年中國衛(wèi)生統(tǒng)計年鑒報告，我國胃癌年死亡率為23.10/10萬，是世界平均水平的2倍多。胃癌已成為嚴重威脅人民群眾身體健康、阻礙社會經(jīng)濟發(fā)展的重大疾

2、病。目前手術(shù)根治是胃癌的主要治療方式，對于早期胃癌患者術(shù)后5年生存率較高，可達90％以上，但絕大部分胃癌在確診時已處于進展期，喪失手術(shù)根治可能，5年生存率僅為11％-40％。西醫(yī)針對中晚期胃癌主要有根治性或姑息性手術(shù)、放化療及免疫治療等治療手段，然而全球范圍的中晚期胃癌的西醫(yī)療效并不理想，那么，中醫(yī)藥在治療中晚期胃癌的治療中就有了相當?shù)陌l(fā)揮余地。因此，繼續(xù)尋找特異性強、高效低毒的抗腫瘤藥物，具有較強的臨床和現(xiàn)實意義。
　　近年來，

3、中醫(yī)藥在胃癌的預防及治療中發(fā)揮著較突出的作用，體外多項研究已證實中藥抗腫瘤效果確切。臨床實踐表明，單獨應用中藥或中藥復方治療胃癌療效確切，同時能減輕放化療的毒副作用。黃藥子為薯截科植物黃獨(DioscoreabulbiferaL.)的塊莖，其性寒涼，味苦，具有涼血、消癭、降火、解毒的作用。黃藥子在臨床應用廣泛，主治多種病癥。既往的文獻報道，中藥黃藥子具有強大的抗腫瘤作用，臨床報道運用含有黃藥子的黃白胃癌湯、抗癌乙片等治療胃癌、賁門癌和食

4、道癌療效確切。還有報道稱黃藥子對肝癌、乳腺癌、宮頸癌、原發(fā)性支氣管肺癌、淋巴瘤等也有一定療效。相關(guān)研究表明中藥抗腫瘤機制包括:抑制原癌基因的表達，促進抑癌基因的表達;調(diào)控癌變組織周圍環(huán)境;誘導癌細胞凋亡;降低胃癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力等。但有關(guān)黃藥子治療胃癌的具體機制尚不清楚。
　　為探討上述問題，本研究擬通過觀察黃藥子對體外培養(yǎng)的胃癌細胞株的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性生物學行為的影響，初步探討其作用的分子機制;并建立裸鼠胃癌皮下移植瘤動

5、物模型，觀察黃藥子對荷瘤鼠的生長抑制的影響。本研究對黃藥子治療胃癌提供科學的理論和實驗依據(jù)，同時對豐富中醫(yī)抗腫瘤理論，促進中醫(yī)臨床轉(zhuǎn)化具有重要意義。
　　目的：
　　1.通過觀察黃藥子對體外胃癌細胞株SGC-7901氧化還原能力、生長增殖及轉(zhuǎn)移能力的影響，探討黃藥子抑制胃癌生長轉(zhuǎn)移的分子機制。
　　2.通過觀察黃藥子對胃癌動物模型腫瘤生長的影響，探討黃藥子的抑瘤效果。
　　方法：
　　1.體外培養(yǎng)胃癌細胞，

6、黃藥子使用乙醇提取，制成不同濃度溶液。
　　2.分光光度法檢測不同濃度的黃藥子乙醇提取物對胃癌細胞羥基自由基和DPPH自由基清除率。
　　3.ABTS快速試驗檢測不同濃度的黃藥子醇提取物對胃癌細胞的抗氧化能力及還原能力。
　　4.MTT法檢測不同濃度的黃藥子醇提取物對胃癌細胞的增殖影響。
　　5.流式細胞術(shù)檢測不同濃度的黃藥子醇提取物對胃癌細胞凋亡的影響。
　　6.Transwell侵襲性檢測不同濃度的黃藥

7、子醇提取物對胃癌細胞侵襲性的影響。
　　7.建立胃癌裸鼠皮下移植瘤，觀察黃藥子醇提取物對腫瘤生長的影響。
　　8.ELISA檢測胃癌裸鼠外周血中炎性細胞因子的表達情況，觀察黃藥子醇提取物對炎性細胞因子濃度的影響。
　　所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計。檢驗顯著性水準取α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.分光光度法測定結(jié)果表明:不同濃度的黃藥子乙醇提取物具有一定的

8、羥基自由基和DPPH自由基清除率。三種提取物中，濃度2mg/ml，70％乙醇提取物的DPPH自由基清除能力最強，清除率為55.2％;80％乙醇提取物的·OH自由基清除能力最高，清除率為51.2％;70％和90％乙醇提取物對·OH自由基清除率分別為38.7％和39.6％。
　　2.還原能力的測試結(jié)果顯示:黃藥子醇提取物具有較強的還原能力。70％的乙醇提取物還原能力為每1克提取物相當于28.1μmolFe2+，80％的乙醇提取物還原能

9、力為每1克提取物相當于49.3μmolFe2+，90％的乙醇提取物還原能力為每1克提取物相當于35.2μmolFe2+，其中80％的乙醇提取物具有最強的還原能力。
　　3.ABTS快速檢測試驗結(jié)果表明:黃藥子醇提取物具有較強的抗氧化能力。80％乙醇提取物的清除能力最強，接近72％。70％和90％乙醇提取物的清除率分別為55％和45％。隨著時間的推移和濃度增大總抗氧化能力逐漸增加。最低濃度為0.2mg/ml時，其清除率為8％。最高濃

10、度為2mg/ml，清除率為52％。在4min、7min、12min，濃度為0.2、0.4、1.0mg/ml時，清除率穩(wěn)步上升。當濃度分別為1.4、1.8、2mg/ml時，自由基清除率變化均不明顯，一般在55％和67％之間波動。
　　4.MTT法細胞增殖實驗結(jié)果顯示:不同濃度乙醇黃藥子提取物溶液均能抑制胃癌SGC-7901細胞的增殖。其中，黃藥子70％乙醇提取物溶液0.5、1、2mg/ml抑制胃癌SGC-7901細胞增殖率分別為34

11、.5％、41.2％和45.6％;黃藥子80％乙醇提取物溶液0.5、1、2mg/ml抑制胃癌SGC-7901細胞增殖率分別為41.3％、55.8％和62.3％;黃藥子90％乙醇提取物溶液0.5、1、2mg/ml抑制胃癌SGC-7901細胞增殖率分別為28.7％、32.4％和34.9％;以2mg/ml的黃藥子80％乙醇提取物的抑制率最高，達62.3％。
　　5.流式細胞儀細胞凋亡檢測結(jié)果顯示:培養(yǎng)48h后，黃藥子醇提取物可明顯促進SG

12、C-7901細胞的凋亡，而對照組SGC-7901細胞只出現(xiàn)少量的凋亡。0.5、1和2mg/ml黃藥子70％乙醇提取物處理的SGC-7901細胞凋亡率從空白對照組的（3.8l±1.56）％分別上升至(5.36±1.85)％、(10.31±2.46)％(P＜0.05)和(18.54±3.26)％(P＜0.01);0.5、1和2mg/ml黃藥子80％乙醇提取物處理的SGC-7901細胞凋亡率分別為(6.62±1.15)％、(14.27±2.2

13、8)％(P＜0.05)和(25.07±4.21)％(P＜0.01)，并呈一定濃度依賴性。0.5、1和2mg/ml黃藥子90％乙醇提取物處理的SGC-7901細胞凋亡率分別為(5.65±1.63)％、(11.81±2.75)％(P＜0.05)和(20.32±3.54)％(P＜0.01)。
　　6.Transwell侵襲性檢測結(jié)果顯示:人胃癌SGC-7901細胞分別與0.5、1、2mg/ml80％黃藥子醇提取物溶液共培養(yǎng)24小時后，細

14、胞侵襲數(shù)目與空白對照組相比，呈降低趨勢。高倍鏡下對穿過下室面的細胞數(shù)進行計數(shù)，對照組為94.36±9.51個，0.5mg/ml黃藥子80％乙醇提取物組為67.52±7.48個，1mg/ml黃藥子80％乙醇提取物組為51.24±6.51個，2mg/ml80％黃藥子醇提取物組為38.59±5.43個，與對照組比較，0.5、1、2mg/ml80％黃藥子醇提取物可以抑制人胃癌細胞株SGC-7901的侵襲(P＜0.05)，且呈劑量依賴關(guān)系。

15、>　　7.建立裸鼠胃癌皮下移植瘤模型情況
　　將瘤塊植入裸鼠皮下后，生長至第7天，形成局部可測量瘤灶，造模成功率100％;皮下腫瘤前期生長較緩，外觀呈球形或半球形，初起可活動，日漸變硬，腫瘤大小不一，觀察期內(nèi)各組裸鼠均未出現(xiàn)明顯消瘦及體重下降。
　　8.黃藥子醇提取物對荷瘤裸鼠腫瘤體積的影響
　　治療結(jié)束后，黃藥子高劑量組瘤體積小于模型組(P＜0.05)，5-FU組和黃藥子低劑量組瘤體積與模型對照組比較無統(tǒng)計學差異(P

16、＞0.05)，黃藥子高劑量組與低劑量組及5-FU組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，5-FU組和黃藥子低、高劑量組三者對瘤體積的抑制率分別為25％、17.86％和39.29％。
　　9.黃藥子醇提取物對荷瘤裸鼠腫瘤質(zhì)量的影響
　　與模型對照組比較，5-FU組和黃藥子高劑量組裸鼠移植瘤質(zhì)量顯著下降(P＜0.05)，黃藥子不同劑量組之間瘤質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，高低劑量黃藥子組瘤質(zhì)量與5-FU組比較，差

17、異亦無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，5-FU組和黃藥子低、高劑量組對荷瘤裸鼠瘤質(zhì)量的抑制率分別為37.5％、25％和43.75％。
　　10.黃藥子醇提取物對裸鼠皮下移植瘤外周血血清IL-8水平的影響
　　與模型對照組比較，5-FU組和黃藥子組裸鼠血清IL-8水平顯著下降(P＜0.05);黃藥子高劑量組血清IL-8水平明顯低于低劑量組(P＜0.05)。
　　11.黃藥子醇提取物對裸鼠皮下移植瘤外周血血清sICAM-1水平

18、的影響
　　與模型對照組比較，5-FU組和黃藥子組裸鼠血清sICAM-1水平顯著下降(P＜0.05);黃藥子高劑量組血清sICAM-1水平明顯低于低劑量組(P＜0.05);黃藥子高劑量組血清sICAM-1水平明顯低于5-FU組(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.黃藥子醇提取物對人胃癌SGC-7901細胞具有一定的自由基清除能力和較強的抗氧化還原能力;
　　2.黃藥子醇提取物能抑制人胃癌SGC-7901細胞的增