腸道病毒71型的生物信息學(xué)分析及其Oligo探針設(shè)計(jì).pdf

1、腸道病毒71型(enterovirus type 71,簡(jiǎn)稱EV71)是手足口病(hand foot andmouth disease,HFMD)的主要病原體,其感染性強(qiáng)且致病率高,可以導(dǎo)致手足口病、無菌性腦膜炎(Asepicmeningitis)、腦炎(Encephalitis)和脊髓灰質(zhì)炎樣的麻痹性疾病(Poliomyelitis-like paralysis)等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。EV71傳染性強(qiáng),常見全家發(fā)病,并可造成局部暴發(fā)流行

2、?；颊咭?～5歲以下小兒多見,成人也可患病,但病情多較輕。一年四季均可發(fā)病,以5、6月份為多發(fā)。潛伏期2～5日。傳播途徑不僅是糞-口傳播,病毒主要通過人群間的密切接觸進(jìn)行傳播,人群密集處易發(fā)生病毒的流行,幼托機(jī)構(gòu)內(nèi)的學(xué)齡前兒童是感染的高危人群。進(jìn)入21世紀(jì)以來EV71引起的手足口病疫情在我國(guó)及世界多個(gè)國(guó)家和地區(qū)多次大規(guī)模出現(xiàn),對(duì)人類健康、經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)穩(wěn)定造成了嚴(yán)重的危害。
　　 EV 71可感染免疫缺陷者、新生兒及幼兒,造成嚴(yán)

3、重后果,甚至威脅生命。由于是EV71引起的手足口病,與柯薩奇A組和B組的一些病毒引起的手足口病在臨床上難以區(qū)分,而且Cox16爆發(fā)往往伴隨著EV71的流行,而且EV71可引起的臨床癥狀與其他病毒引起的初期癥狀極為相似,因此EV 71是所有腸道病毒中最難鑒定的病毒之一。因此早期、快速、準(zhǔn)確的診斷對(duì)EV71的預(yù)防和隔離至關(guān)重要。目前常用的實(shí)驗(yàn)室診斷方法包括病毒分離培養(yǎng)、免疫學(xué)方法、PCR技術(shù)等,但分別存在難以早期診斷、敏感度低或假陽性率高等

4、缺陷。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,基因芯片技術(shù)因其具有高通量性、快速、準(zhǔn)確性強(qiáng)等特點(diǎn),成為新興的病毒檢測(cè)技術(shù)。本課題研究借助生物信息學(xué)技術(shù)和探針設(shè)計(jì)軟件,探索對(duì)EV71病毒感染的早期、敏感、準(zhǔn)確和快速檢測(cè)的探針設(shè)計(jì),為以后打印成適用的基因檢測(cè)芯片打下基礎(chǔ)。
　　 基因芯片技術(shù)是近年發(fā)展起來的一種新型、高效、快速、敏感的核酸分析與檢測(cè)方法,基因芯片技術(shù)因其具有高通量性、快速、準(zhǔn)確性強(qiáng)等特點(diǎn),成為新興的病毒檢測(cè)技術(shù)。目前國(guó)內(nèi)尚無使用基

5、因芯片對(duì)腸道病毒進(jìn)行檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。鑒于腸道病毒引發(fā)疾病的早期診斷對(duì)后期的疾病防治工作意義重大,可使用基因芯片技術(shù)針對(duì)并發(fā)癥較嚴(yán)重之EV 71、Cox A15、Cox A16、Cox B3等多種腸道病毒的特定基因序列所設(shè)計(jì)出檢測(cè)芯片快速診斷腸道病毒感染的具體類型,及時(shí)制定治療措施,提高疾病防治水平。因此使用基因芯片技術(shù)對(duì)腸道病毒進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)的臨床應(yīng)用前景非常廣闊。
　　 近年來迅速發(fā)展的長(zhǎng)鏈寡核苷酸基因芯片技術(shù)(60-70 me

6、r OligoMicroarray),為從基因水平高度特異性的檢測(cè)EV71提供了可能。長(zhǎng)鏈寡核苷酸探針用作基因芯片探針是近年來在基因芯片研究領(lǐng)域出現(xiàn)的一項(xiàng)新技術(shù),生物信息學(xué)研究表明,一條長(zhǎng)鏈寡核苷酸即可代表一個(gè)基因,同時(shí)又具有較高的特異性,因此,長(zhǎng)鏈寡核苷酸探針集傳統(tǒng)cDNA和短鏈寡核苷酸探針的優(yōu)點(diǎn)于一身,在一定程度上克服了傳統(tǒng)探針的缺點(diǎn),是制作EV71檢測(cè)芯片最合適的選擇。
　　 通過生物信息學(xué)研究分析基因芯片探針是一種簡(jiǎn)便,

7、經(jīng)濟(jì)的方法,運(yùn)用生物信息學(xué)工具對(duì)基因芯片探針進(jìn)行設(shè)計(jì)可以大大減少花費(fèi)時(shí)間、提高工作效率。運(yùn)用生物信息學(xué)方法從核酸數(shù)據(jù)庫中取得基因序列,然后通過序列比對(duì)分析,找出其特征序列,作為探針設(shè)計(jì)的參照序列。序列比對(duì)分析是生物信息學(xué)中最常用的方法,生物信息學(xué)中常用的核酸序列搜索比較算法是BLAST。各種亞型的基因組序列存在堿基插入、缺失和替換而導(dǎo)致的細(xì)微差別。利用多重序列比較可以發(fā)現(xiàn)基因序列中相對(duì)保守的區(qū)域,因此可以選擇這段保守區(qū)作為芯片設(shè)計(jì)的參考

8、序列。用生物信息學(xué)探針設(shè)計(jì)軟件分析保守序列即可獲得特異探針。
　　 本研究首先確立了長(zhǎng)鏈寡核苷酸基因芯片實(shí)驗(yàn)的基本條件,以保證各種參數(shù)盡量控制在最佳范圍,以保證在同一張芯片上的探針在相同的雜交、清洗條件下得到最佳的雜交效果,并確定了用于寡核苷酸芯片雜交檢測(cè)所需要的最佳探針片段長(zhǎng)度。長(zhǎng)鏈寡核苷酸探針序列長(zhǎng)度一般在60-170 mer,60mer的探針盡管合成成本較低,但特異性及固定率均不如70 mer長(zhǎng)度的探針:由于70 mer的

9、寡核苷酸芯片能兼顧雜交的特異性和信號(hào)強(qiáng)度,已經(jīng)被越來越多的實(shí)驗(yàn)室所接受。
　　 本研究首先登錄NCBI(National Center for Biotechnology Information)網(wǎng)站GenBank數(shù)據(jù)庫通過搜索獲得最新的EV71基因組全長(zhǎng)序列,然后將病毒的基因組全長(zhǎng)序列使用NCBI的在線BLAST(Basic local alignment search tool)功能進(jìn)行BLAST比對(duì)分析,結(jié)果獲得EV71的

10、保守序列及型特異性序列,作為設(shè)計(jì)Oligo探針的備選序列。
　　 利用生物學(xué)軟件Oligo 6.71分別對(duì)BLAST檢索所得病毒的種屬保守序列和型特異性序列逐一進(jìn)行分析,設(shè)計(jì)長(zhǎng)度均一的70 mer的Oligo探針,并對(duì)其進(jìn)行BLAST比對(duì),為減少非特異性雜交,保證芯片雜交的敏感度和精確度,采用了嚴(yán)格的遴選標(biāo)準(zhǔn),從中篩選出特異性較高的12條探針,作為制備EV71寡核苷酸檢測(cè)基因芯片的首選探針序列。本研究使用生物信息學(xué)方法對(duì)EV71

11、的基因序列進(jìn)行比對(duì),得到有意義的特異序列；用生物學(xué)軟件Oligo 6.71為基因芯片設(shè)計(jì)特異性高、Tm值相近、長(zhǎng)度均一的Oligo探針,為基因芯片在臨床診斷中的應(yīng)用作出了貢獻(xiàn)。
　　 本課題通過實(shí)驗(yàn)室研究,得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 1、使用基因芯片技術(shù)對(duì)EV71進(jìn)行診斷,其主要優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)檢測(cè)多段基因,而且具有較高的靈敏度。同時(shí),由于分子雜交本身即具有較高的嚴(yán)謹(jǐn)性,應(yīng)用多組探針聯(lián)合判斷檢測(cè)結(jié)果,也可以有效的降低檢測(cè)的

12、假陽性率。此外,因基因芯片本身具備高通量大規(guī)模的特點(diǎn),將基因芯片用于鑒別診斷最有優(yōu)勢(shì),可以將多種與EV71早期癥狀類似的病毒如柯薩奇、皰疹病毒、?？刹《?、輪狀病毒等常見病原體點(diǎn)樣到芯片上進(jìn)行聯(lián)合診斷,對(duì)于確診病人、排除疑似患者具有重要意義。設(shè)計(jì)出能與靶分子特異結(jié)合的探針是準(zhǔn)確檢測(cè)病毒基因的關(guān)鍵。用于病原體檢測(cè)或診斷的寡核苷酸探針可針對(duì)病原體基因的保守序列或是與疾病相關(guān)的特異基因來進(jìn)行設(shè)計(jì)。長(zhǎng)鏈寡核苷酸探針序列長(zhǎng)度一般在60-70 mer

13、,60mer的探針盡管合成成本較低,但特異性及固定率均不如70 mer長(zhǎng)度的探針；由于70 mer的寡核苷酸芯片能兼顧雜交的特異性和信號(hào)強(qiáng)度,在本研究中我們采用了70 mer的探針序列。
　　 2、本研究首先直接通過生物信息學(xué)軟件從網(wǎng)上GenBank等數(shù)據(jù)庫調(diào)取目標(biāo)序列,然后構(gòu)建分析項(xiàng)目,再分別對(duì)各基因的基因序列進(jìn)行全長(zhǎng)比對(duì),通過比對(duì)后再進(jìn)行探針設(shè)計(jì)就能避免探針的交叉同源性。在進(jìn)行探針設(shè)計(jì)時(shí)可據(jù)比對(duì)結(jié)果剔除同源性高的區(qū)段,低的區(qū)

14、段再行二次甚至三次比對(duì),并選擇再次比對(duì)結(jié)果中相似性分選擇再次比對(duì)結(jié)果中相似性分?jǐn)?shù)值<40的區(qū)段作為特異性序列。這些特異性序列和GenBank國(guó)際數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)中其他現(xiàn)有全部序列的同源性最低,可大大減少非特異性雜交,提高檢測(cè)的精確度及BLAST分析的效率。
　　 3、在用Oligo 6.71對(duì)探針進(jìn)行設(shè)計(jì)時(shí),選擇70 mer長(zhǎng)度均一的Oligo作為探針可使雜交條件趨向均一,靈敏度增高。對(duì)備選探針進(jìn)行篩選時(shí),各種參數(shù)盡量控制在最佳范圍,

15、以保證同一張芯片上的探針在相同的雜交、清洗條件下得到最佳的雜交效果。探針最穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的配對(duì)堿基長(zhǎng)度小于6 bp,G趨于0或?yàn)檎?保證探針內(nèi)部不會(huì)形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)而影響探針與芯片雜交的效率。本研究利用NCBI網(wǎng)站中的GenBank數(shù)據(jù)庫的BLAST功能及生物學(xué)軟件Oligo 6.71成功設(shè)計(jì)特異性高、長(zhǎng)度一致、融解溫度相近的Oligo探針12條,為后期合成基因芯片,用于EV71的檢測(cè)打下了基礎(chǔ),可以較好的用于進(jìn)一步的芯片實(shí)驗(yàn)階段。<