N-甲基-D-天冬氨酸受體2B亞基鎮(zhèn)痛疫苗應(yīng)用于大鼠的安全性評價.pdf

1、研究背景：
　　 本研究通過四個方面的觀察，評價rAd5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗應(yīng)用于大鼠疼痛治療的安全性。
　　 1. rAd5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗對谷氨酸誘導(dǎo)的離體海馬神經(jīng)元凋亡的影響：利用 rAd5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗免疫大鼠，提取免疫血清，并在體外培養(yǎng)大鼠原代海馬神經(jīng)元，加入免疫血清，觀察神經(jīng)元胞內(nèi)鈣及其凋亡的變化；2. rAd5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗對大鼠體內(nèi)神經(jīng)元凋亡的影響：大鼠經(jīng)rAd5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗免疫后，通過免疫

2、組織化學(xué)染色和Western blot方法分別檢測大鼠脊髓和海馬組織中活化Caspase-3蛋白的表達(dá)以評價神經(jīng)元的凋亡情況；3. rAd5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗對大鼠認(rèn)知功能的影響：利用rAd5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗免疫大鼠，Morris水迷宮實驗觀察大鼠空間學(xué)習(xí)與記憶功能的改變，并檢測大鼠海馬組織中NR2B蛋白的表達(dá)水平；4. rAd5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗影響大鼠認(rèn)知功能的電生理學(xué)和分子學(xué)機(jī)制：使用電生理學(xué)檢測方法觀察rAd5/NR2B鎮(zhèn)痛疫

3、苗免疫大鼠海馬組織長時程增強(qiáng)的誘發(fā)和維持，并檢測大鼠海馬組織中磷酸化tau蛋白和NR2B蛋白表達(dá)水平的變化。
　　 研究方法與結(jié)果：
　　 1.rAd5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗對谷氨酸誘導(dǎo)的離體海馬神經(jīng)元凋亡的影響
　　 方法：選取雌性SD大鼠，通過灌胃的方法給予rAd5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗免疫大鼠，2周后以相同的劑量加強(qiáng)免疫一次。初次免疫后4周，斷尾法取靜脈血，制備免疫血清，并通過ELISA檢測血清中NR2B特異性抗體

4、的滴度，同時取正常大鼠靜脈血制備正常大鼠血清。并利用免疫組織化學(xué)染色的方法觀察活化Caspase-3的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：①大鼠經(jīng)rAd5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗免疫4周后，能在血清中發(fā)現(xiàn)較高滴度的NR2B特異性抗體。Fluo-4/AM標(biāo)記的原代神經(jīng)元經(jīng)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)谷氨酸刺激后神經(jīng)元胞內(nèi)鈣濃度明顯升高，正常大鼠血清卻對神經(jīng)元胞內(nèi)鈣濃度沒有影響。②Annexin V-PI雙標(biāo)流式細(xì)胞儀檢測。
　　 2.r

5、Ad5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗對大鼠體內(nèi)神經(jīng)元凋亡的影響
　　 方法：實驗分為6組：空白對照組、單純rAd5/NR2B干預(yù)組、假手術(shù)組、SNI模型組、MK801處理的SNI模型組和rAd5/NR2B處理的SNI模型組。通過免疫組織化學(xué)染色和Western blot的方法分別檢測大鼠脊髓和海馬活化Caspase-3蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：SNI模型建立前各組大鼠間MWT和TWD比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3. r

6、Ad5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗對大鼠認(rèn)知功能的影響
　　 方法：取雌性SD大鼠60只，分組與處理同實驗第二部分。
　　 結(jié)果：① Morris水迷宮實驗中，與Naive組相比，rAd5/NR2B組和Sham組中大鼠的潛伏期和穿越平臺次數(shù)無明顯變化（P>0.05），SNI組、SNI+rAd5/NR2B組和SNI+MK801組中大鼠的潛伏期延長，穿越次數(shù)減少（P<0.05）中。與SNI組相比，SNI+rAd5/NR2B組的潛伏期沒

7、有增加，穿越次數(shù)也沒有縮短（P>0.05），而利用MK801鎮(zhèn)痛后大鼠的潛伏期延長，穿越次數(shù)減少（P<0.05）。6組大鼠的游泳平均速度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。②免疫組織化學(xué)染色和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)：與Naive組相比，rAd5/NR2B組、Sham組和SNI+rAd5/NR2B組中大鼠海馬組織中NR2B蛋白的表達(dá)水平無明顯變化（P>0.05），而SNI組中NR2B表達(dá)水平增高（P<0.05），SNI+MK8

8、01組中表達(dá)水平下降（P<0.05）。與SNI組相比，SNI+rAd5/NR2B組中NR2B表達(dá)水平下降（P<0.05），而SNI+MK801組下降更明顯（P<0.05）。
　　 4. rAd5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗影響大鼠認(rèn)知功能的電生理學(xué)和分子學(xué)機(jī)制
　　 方法：取雌性SD大鼠（體重200g左右）36只，分為6組（n=6）：Naive組、rAd5/NR2B組、Sham組、SNI組、SNI+MK801組和SNI+rAd5/

9、NR2B組。每組的處理同實驗第二部分。SNI模型構(gòu)建后2周，斷頭取腦，制備海馬腦片，記錄大鼠海馬CA1區(qū)興奮性突觸后電位（Field Excitatory Postsynaptic Potential，fEPSP）的變化。利用誘發(fā)最大幅度fEPSP 30～40%的刺激電壓作為單刺激，并穩(wěn)定刺激20min以上，記錄fEPSP曲線，作為fEPSP的基礎(chǔ)值。給予強(qiáng)直刺激（High-frequency stimulation，HFS）后記錄fE

10、PSP幅度和斜率的變化，如增加20%并持續(xù)30min以上視為LTP誘發(fā)成功，同時比較各組大鼠的LTP幅度，依此評價rAd5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗對大鼠LTP的影響。電生理實驗結(jié)束后，提取海馬組織中總蛋白，利用Western-blot的方法檢測磷酸化Tau蛋白和NR2B蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：① 在電生理實驗中，與Naive組相比，rAd5/NR2B組、Sham組和SNI組中大鼠海馬CA1區(qū)fEPSP和LTP幅度均無明顯變化（P

11、>0.05），但SNI+rAd5/NR2B組中海馬腦片經(jīng)HFS處理后雖成功誘發(fā)出LTP，但LTP幅度下降（P<0.05），SNI+MK801組中，海馬CA1區(qū)LTP幅度明顯下降，不僅低于SNI+rAd5/NR2B組（P<0.05），甚至低于20%，視之為LTP誘發(fā)不成功。② 海馬磷酸化Tau蛋白Western blot檢測發(fā)現(xiàn)：6組中大鼠海馬組織中磷酸化tau蛋白的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。③海馬NR2B蛋白Wester

12、n blot檢測發(fā)現(xiàn)：與Naive組相比，rAd5/NR2B組、Sham組、SNI+rAd5/NR2B組和SNI+MK801組中大鼠海馬組織中NR2B蛋白的表達(dá)水平無明顯變化（P>0.05），而SNI組中NR2B表達(dá)水平增高（P<0.05），SNI+MK801組中表達(dá)水平下降（P<0.05）。與SNI組相比，SNI+rAd5/NR2B組中NR2B表達(dá)水平下降（P<0.05），而SNI+MK801組下降更明顯（P<0.05）。
　　

13、 5、統(tǒng)計學(xué)處理
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示，組內(nèi)比較采用重復(fù)變量數(shù)據(jù)方差分析，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 研究總結(jié)：
　　 一 主要研究結(jié)果
　　 1.大鼠經(jīng)rAd5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗免疫4周后，產(chǎn)生較高滴度的NR2B特異性抗體，后者能夠抑制或逆轉(zhuǎn)谷氨酸造成的鈣超載。rAd5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗免疫血清與正常血清

14、相比，能夠減少谷氨酸誘導(dǎo)的原代神經(jīng)元凋亡。
　　 2.在體實驗中，rAd5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗不會誘發(fā)在體脊髓和海馬神經(jīng)元的凋亡，但MK801卻增加了大鼠脊髓和海馬神經(jīng)元的凋亡。
　　 3.通過Morris水迷宮實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)rAd5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗免疫后大鼠的潛伏期、穿越平臺次數(shù)沒有顯著變化，MK801則明顯延長了大鼠的潛伏期，穿越平臺的次數(shù)減少。rAd5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗免疫后的SNI大鼠NR2B表達(dá)水平下降。

15、　　 4.正常大鼠經(jīng)rAd5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗免疫后海馬CA1區(qū)LTP幅度無明顯變化。但疼痛模型大鼠經(jīng)免疫后，fEPSP斜率以及LTP幅度降低，MK801則顯著降低fEPSP斜率，LTP誘發(fā)不成功。rAd5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗對tau蛋白的磷酸化水平無明顯影響，而注射MK801后Tau蛋白的磷酸化水平增高。rAd5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗免疫后的SNI大鼠NR2B表達(dá)水平下降。
　　 二 研究結(jié)論
　　 1.大鼠經(jīng)rAd5/N

16、R2B鎮(zhèn)痛疫苗免疫后產(chǎn)生含較高滴度NR2B特異性抗體的免疫血清，該免疫血清能抑制或逆轉(zhuǎn)谷氨酸造成的鈣超載，并減少谷氨酸誘導(dǎo)的原代神經(jīng)元凋亡，對神經(jīng)元具有一定的保護(hù)作用。
　　 2.rAd5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗不會增加體內(nèi)海馬和脊髓神經(jīng)元的凋亡。
　　 3.rAd5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗對大鼠的空間學(xué)習(xí)與記憶功能沒有明顯的損害。
　　 4.rAd5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗一定程度上降低了大鼠LTP的誘導(dǎo)和維持，但對tau蛋白的

17、磷酸化水平無明顯影響。
　　 本研究中，我們發(fā)現(xiàn)rAd5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗能夠?qū)劝彼嵴T導(dǎo)的體外神經(jīng)元凋亡產(chǎn)生一定的保護(hù)作用，同時對在體神經(jīng)元的凋亡、大鼠的認(rèn)知功能以及tau蛋白的磷酸化沒有明顯影響；電生理和分子學(xué)機(jī)制研究顯示，rAd5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗削弱了大鼠LTP的誘導(dǎo)和維持，而且降低了NR2B的表達(dá)水平。這表明經(jīng)rAd5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗免疫所產(chǎn)生的NR2B特異性抗體，能夠拮抗NR2B并下調(diào)NR2B蛋白表達(dá)水平，以發(fā)揮鎮(zhèn)

18、痛作用，并影響到神經(jīng)元的突觸可塑性，但其幅度有限，不足以誘發(fā)在體神經(jīng)元的凋亡，也不足以影響到大鼠的認(rèn)知功能。這些結(jié)果證明rAd5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗應(yīng)用大鼠鎮(zhèn)痛是安全的，相比其他NMDA受體拮抗劑有明顯的優(yōu)勢。
　　 三 展望
　　 rAd5/NR2B鎮(zhèn)痛疫苗應(yīng)用于神經(jīng)病理性痛大鼠有良好的鎮(zhèn)痛效果，是一種新穎、有效的鎮(zhèn)痛方法。同時，rAd5/NR2B對大鼠的生理功能沒有明顯影響，安全性較高，具有極大的臨床推廣價值。但是，我