金黃色葡萄球菌臨床分離株的基因分型與毒素基因多樣性.pdf

1、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種重要的臨床和食源性致病菌，20-40％的健康人群的皮膚或粘膜表面都有金黃色葡萄球菌寄居，存在很高的潛在感染性。金黃色葡萄球菌可以分泌多種引發(fā)人類疾病的毒力因子，例如，有些菌株能夠產(chǎn)生毒性休克綜合征毒素(toxicshock syndrome toxin，TSST);有些菌株能夠產(chǎn)生引起皮膚感染的表皮剝脫毒素(exfoliatin toxin，ET);而有些菌株能夠表達(dá)耐熱

2、的腸毒素(staphylococal enterotoxin，SE)。這三大類毒素是金黃色葡萄球菌最重要的致病因子，能夠引起中毒性休克綜合征、皮膚感染和化膿及胃腸炎等，而且編碼這些毒力因子的基因大多數(shù)位于金黃色葡萄球菌攜帶的可移動基因元件上，可通過水平轉(zhuǎn)移傳播，增強金黃色葡萄球菌的致病力和遺傳多樣性。因此，分析不同背景來源的金黃色葡萄球菌攜帶的毒素基因多樣性，結(jié)合基因分型結(jié)果，為明確流行環(huán)節(jié)、追蹤傳染源、切斷傳播途徑，從而為減少和控制感

3、染奠定理論基礎(chǔ)。因此，本論文的主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1、利用特異性擴增PCR調(diào)查了22種毒素基因在中國14個城市16家不同醫(yī)院分離得到的108株金黃色葡萄球菌臨床分離菌株中的多樣性分布，包括18種腸毒素基因sea-see、seg-ser、seu，3種表皮剝脫毒素基因eta、etb、et及中毒性休克綜合征毒素基因tsst。結(jié)果顯示，高達(dá)90.7％的金黃色葡萄球菌菌株都攜帶毒素基因，包含47種不同的毒素基因組合（即毒素基因型）

4、，其中80株菌株攜帶兩種或兩種以上不同種類的毒素基因，2株菌株攜帶多達(dá)12種不同種類毒素基因;攜帶率最高的毒素基因是tsst(48.1％)，其次分別是sea(44.4％)，sek(42.6％)，和seq(40.7％)，而see和etb沒有檢出;某些特定的毒素基因組合如sea-sek-seq、egc等在金黃色葡萄球菌菌株中的高檢出率，揭示了毒素基因的高度多樣性和可移動基因元件在菌株間的頻繁轉(zhuǎn)移;除seb，seu和eta只在MSSA菌株中檢

5、測到外，其他毒素基因在MRSA和MSSA菌株中均有分布，而且所有MRSA菌株都是毒素基因陽性菌株。
　　2、利用多位點序列分型(MLST)評價了108株金黃色葡萄球菌臨床分離株的遺傳多樣性，獲得了25個不同的序列型(STs)。它們分布在16個不同的克隆系(CCs);除ST120和11個新的ST外，其他序列型都包含兩株或兩株以上菌株;ST239是分布最廣的一個序列型，對應(yīng)的CC239是本研究中最大的克隆系，包含ST239和兩個新的S

6、T(1923和1924);所有CC239中的35株金黃色葡萄球菌都是MRSA，其他4株MRSA屬于CC5;另外得到了7個新的等位基因和11個新的STs，已分別提交至GenBank和MLST數(shù)據(jù)庫，并被接受;6個已知ST型(ST6，7，15，25，120，630)首次在中國地區(qū)來源的金黃色葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)，補充了中國地區(qū)來源的金黃色葡萄球菌的MLST數(shù)據(jù)庫信息。
　　3、為了進一步分析金黃色葡萄球菌分離株的遺傳多樣性及與地域來源的相關(guān)

7、性，利用脈沖場凝膠電泳(PFGE)對108株金黃色葡萄球菌分離株進行了分型。PFGE結(jié)果使用BioNumerics軟件分析，在80％相似度的基礎(chǔ)上，采用Dice coefficients and UPGM構(gòu)建進化樹，將分離株分為25個不同的PFGE型;一些樣品來源相同的金黃色葡萄球菌分離菌株被聚類到不同的PFGE型;而一些不同樣品和地區(qū)來源的金黃色葡萄球菌分離菌株被聚類到相同的PFGE型;在25個PFGE型內(nèi)，有18個PFGE型包含兩個

8、或更多不同醫(yī)院來源的金黃色葡萄球菌分離株，17個PFGE型包含兩類或更多類臨床樣品來源的金黃色葡萄球菌分離株;39株MRSA分布在6個不同PFGE型，而69株MSSA分布在多達(dá)19個不同的PFGE型。這些結(jié)果還難以揭示PFGE型與菌株的地域來源及甲氧西林耐藥性之間的密切相關(guān)性。
　　4、agr是金黃色葡萄球菌中大多數(shù)毒力基因的調(diào)控因子，為了探究agr型與毒素基因間是否存在相關(guān)性，利用多重PCR方法對108株金黃色葡萄球菌分離株進行

9、了agr基因分型。結(jié)果顯示，四種agr基因型在108株金黃色葡萄球菌中均有分布，其中agrⅠ型菌株所占比例最高(60.2％)，接下來是agrⅢ型(19.4％)、agrⅡ型(16.7％)、agrⅣ(2.8％)、一株金黃色葡萄球菌agr PCR擴增陰性;agr基因型與毒素基因之間未顯示出相關(guān)性;而agr型與MLST型之間有密切相關(guān)性，每一個MLST型對應(yīng)單一agr型。
　　5、從108株金黃色葡萄球菌分離株中隨機選取了52株進行全自動

10、核糖體分型(Ribotyping)，并將其結(jié)果與MLST和PFGE分型結(jié)果進行比較，使用辛普森指數(shù)比較三種基于不同原理的分型方法的分辨能力。結(jié)果顯示，核糖體分型得到29個唯一的核糖型，其辛普森指數(shù)為D=0.965;PFGE聚類得到20個唯一的PFGE型，其辛普森指數(shù)為D=0.949; MLST得到17個序列型，其辛普森指數(shù)為D=0.937。從辛普森指數(shù)值可以看出，核糖體分型的分辨能力最強。
　　6、比較分析了47種毒素基因型與PF

11、GE和MLST分型結(jié)果，并討論了它們所反映的遺傳背景之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，在相同的PFGE型或MLST克隆系內(nèi)的金黃色葡萄球菌菌株攜帶不同的毒素基因型，攜帶的毒素基因種類從1-12種不等，與菌株的遺傳背景之間未顯示出密切相關(guān)性;除了71％攜帶sea-sek-seq的菌株來源于兩家醫(yī)院并且屬于相同的MLST克隆系239內(nèi)，大部分MLST克隆系或PFGE型含有一種以上不同的毒素基因型，揭示了毒素基因型更具多樣性。
　　7、利用酶聯(lián)免

12、疫試劑盒檢測了五種傳統(tǒng)腸毒素SEA-SEE，并利用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)在mRNA水平上對18種腸毒素基因(sea-see，seg-ser，seu)進行了表達(dá)檢測;同時，利用反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR，在mRNA水平上研究了不同腸毒素基因及其在不同環(huán)境條件下的相對表達(dá)差異。結(jié)果顯示，傳統(tǒng)腸毒素的檢測和腸毒素基因在mRNA水平的表達(dá)檢測結(jié)果均與PCR檢測結(jié)果一致;不同腸毒素基因間相對表達(dá)存在差異，攜帶腸毒素基因的菌株間毒素基因的相對表達(dá)水

13、平也存在差異，從mRNA水平上揭示了金黃色葡萄球菌分離株的多樣性。
　　8、利用變換傅里葉衰減全反射紅外光譜技術(shù)，以14株非葡萄球菌屬標(biāo)準(zhǔn)菌株，3株葡萄球菌屬標(biāo)準(zhǔn)菌株和84株葡萄球菌屬臨床分離株為實驗菌株，結(jié)合統(tǒng)計方法，采用兩步法正確鑒定了金黃色葡萄球菌，通過內(nèi)部驗證和外部驗證考察了所建模型的鑒定能力。第一步，在波段1800-1050cm-1范圍，利用非監(jiān)督型方法HCA，正確鑒定了38株金黃色葡萄球菌，但是有20株金黃色葡萄球菌被