金黃色葡萄球菌毒素基因檢測,SCCmec分型及耐藥性分析.pdf

1、目的：
　　 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)是臨床上常見的致病性較強(qiáng)的細(xì)菌之一,在臨床重癥感染中占據(jù)十分重要的位置。特別是耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA),近年來由其所致院內(nèi)感染暴發(fā)流行的報道不斷出現(xiàn),多重耐藥性使其成為當(dāng)今抗感染治療領(lǐng)域一個非常棘手的問題。殺白細(xì)胞毒素(Panton-Valentin

2、e leukocidin,PVL)和中毒性休克綜合征毒素-1(toxic shock syndrome。Toxin1,TSST-1)是SA產(chǎn)生的兩種重要外毒素。攜帶毒素因子的SA毒力更強(qiáng),導(dǎo)致的臨床表現(xiàn)和癥狀更加嚴(yán)重,進(jìn)一步增加臨床治療的困難。本研究詣在調(diào)查中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院臨床分離SA菌株中MRSA的比率及其耐藥性,MRSA的Sccmec基因型分布和不同基因型的MRSA的耐藥狀況,MRSA和甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(meth

3、icillin-sensitiveStaphylococcus aureus,MSSA)PVL基因和TSST-I基因的攜帶情況,為臨床治療及感染控制提供依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 (一)實(shí)驗(yàn)菌株
　　 標(biāo)本為中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院臨床微生物室保存的臨床分離菌株。
　　 (二)實(shí)驗(yàn)試劑
　　 細(xì)菌基因組提取試劑盒(CWBIO康為世紀(jì)公司);2×Taq Master

4、Mix(CWBIO康為世紀(jì)公司);藥敏試驗(yàn)用Muller Hinton瓊脂培養(yǎng)基(法國生物梅里埃公司);藥敏紙片(英國oxoid公司);瓊脂糖(美國Sigma公司);引物(Invitrogin公司);DNA marker(大連寶生物工程有限公司)等。
　　 (三)實(shí)驗(yàn)儀器
　　 臺式低溫高速離心機(jī)(基因有限公司)、PCR循環(huán)儀(TaKaRa)、瓊脂糖凝膠電泳儀(BAYGENE)、凝膠成像儀(基因有限公司)等。
　　

5、 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、采用紙片擴(kuò)散法(Kirby-Bauer法)對臨床標(biāo)本分離的48株SA作藥敏試驗(yàn)并分析藥敏結(jié)果。
　　 2、提取SA的DNA,應(yīng)用PCR技術(shù)以DNA為模板擴(kuò)增出PVL、TSST-1基因,應(yīng)用多重PCR技術(shù)檢測MRSA的SCCmec基因型及亞型。
　　 3、將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像儀拍照觀察結(jié)果,測序并分析。
　　 4、統(tǒng)計學(xué)處理:應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,對數(shù)據(jù)

6、進(jìn)行X2檢驗(yàn),P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 一、MRSA的檢測
　　 48株SA經(jīng)頭孢西丁紙片擴(kuò)散法檢測,29株為MRSA,其中28株應(yīng)用PCR法檢測其攜帶mecA基因,MRSA檢測以PCR法為標(biāo),故MRSA所占比率為58.3％(28/48)。
　　 二、藥敏試驗(yàn)結(jié)果
　　 28株MRSA對青霉素和頭孢西丁均耐藥,對替考拉寧、萬古霉素和利奈唑胺的敏感率為100％,對苯唑西林、紅霉

7、素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、克林霉素、慶大霉素、四環(huán)素的耐藥率分別為92.9％、92.9％、89.3％、89.3％、89.3％、78.6％、78.6％;20株MSSA對以上抗菌藥物的敏感率明顯高于MRSA,其中對頭孢西丁、苯唑西林、克林霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素、利福平的耐藥率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。SCCmecⅡ型、SCCmecⅢ型和SCCmecⅢA型菌株除對β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥外,對其他抗菌藥物呈現(xiàn)多重耐藥;SCC

8、mecⅣ型菌株除對β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥外,對其他抗菌藥物均敏感。
　　 三、MRSA的SCCmec基因分型
　　 28株MRSA中,SCCmecⅡ型14株(50％),SCCmecⅢ型6株(21.4％),SCCmecⅢA型3株(10.7％),SCCmecⅣ型2株,未分型3株。
　　 四、PVL基因檢測
　　 48株SA中,PVL陽性菌株的分離率是10.4％(5/48),其中PVL陽性MRSA為1株(1/28

9、,3.6％),PVL陽性MSSA為4株(4/20,20％),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 五、TSST-1基因檢測
　　 48株SA中,TSST-1陽性菌株的分離率是29.2％(14/48),其中TSST-1陽性MRSA為12株(12/28,42.9％),TSST-1陽性MSSA為2株(2/20,10％),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 六、基因測序
　　 mecA、PVL、TSST