核苷酸焦磷酸酶基因多態(tài)性與脊柱后縱韌帶骨化程度及骨化進(jìn)展相關(guān)的初步研究.pdf

1、后縱韌帶骨化(ossification of posterior longitudinal ligament,OPLL)是一種起源于韌帶組織的異位骨化性病變。1938年,Key第一次描述了頸椎的后縱韌帶骨化可引起脊髓受壓而產(chǎn)生臨床癥狀。其病因至今仍未明了,先后有學(xué)者提出了椎間盤變性學(xué)說、鈣代謝異常學(xué)說、機(jī)械損傷學(xué)說,等等。至今仍都停留在推測及學(xué)說階段。隨著分子生物技術(shù)以及基因技術(shù)的迅速發(fā)展并應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,眾多學(xué)者希望從分子水平甚或基因

2、水平上找到OPLL的發(fā)病基礎(chǔ),以及基因變化與病情演變、預(yù)后甚至骨化進(jìn)展的關(guān)系,力求從根本上解釋臨床出現(xiàn)的諸多問題。研究發(fā)現(xiàn)核苷酸焦磷酸酶(Nucleotide pyrophosphatase,NPPS)基因多態(tài)性、人類α2膠原(human collagen alpha2(XI),COL11A2)等基因的多態(tài)性在后縱韌帶骨化起始、形成以及骨化程度均有一定程度的影響。 Koga等研究證明OPLL致病基因位于靠近HLA復(fù)合體第六號染色

3、體上。為此,Okawa等利用TTW大鼠模型研究發(fā)現(xiàn):TTW大鼠的OPLL表型是由于NPPS基因無意義突變造成的。TTW大鼠具有與人類的后縱韌帶骨化相類似遺傳素質(zhì),易于發(fā)生后縱韌帶骨化,常作為研究后縱韌帶骨化的動物模型。NPPS基因編碼核苷酸焦磷酸酶,從而調(diào)節(jié)軟組織的鈣化和骨礦物質(zhì)的沉積。核苷酸焦磷酸酶是無機(jī)焦磷酸鹽(PPi)產(chǎn)生的主要作用酶,PPi是機(jī)體抑制組織鈣化的主要抑制劑,NPPS功能失常導(dǎo)致PPi水平下降,促進(jìn)異位組織包括韌帶組

4、織骨化。許多報道提出NPPS基因不同位點突變與脊柱的后縱韌帶骨化易感性、以及骨化程度有一定的相關(guān)性。Koshizuka等應(yīng)用單核苷酸多態(tài)性(SNPs)研究的方法對部分OPLL患者的NPPS基因進(jìn)行分析,并發(fā)現(xiàn)靠近16號外顯子的15號內(nèi)含子的14位“T”被“C”替代(IVS15-14T→C),其基因類型突變與OPLL的發(fā)生率以及骨化的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。Tahara提出NPPS基因IVS20-11delT與OPLL的骨化發(fā)生率無明確的相關(guān)性

5、,但在OPLL伴有胸椎后縱韌帶骨化患者中有較高的發(fā)生率且有意義。目前國內(nèi)均未見有關(guān)核苷酸焦磷酸酶影響骨化即羥基磷灰石沉積的機(jī)制以及微觀上表達(dá)、脊柱后縱韌帶骨化程度與NPPS基因多態(tài)性相關(guān)性的研究。 近來國外文獻(xiàn)報道：頸椎OPLL手術(shù)后病人,尤其是后路術(shù)后OPLL有明顯發(fā)展的跡象,且OPLL繼續(xù)進(jìn)展的比率高達(dá)70％左右,少數(shù)患者甚至再次出現(xiàn)明顯的脊髓或神經(jīng)受壓癥狀。分析其原因,許多學(xué)者提出與手術(shù)導(dǎo)致后結(jié)構(gòu)破壞,椎管的張力減小、后縱

6、韌帶承受機(jī)械應(yīng)力增加有關(guān)系。有研究提出：脊柱韌帶在局部應(yīng)力變化的環(huán)境下,不但是應(yīng)力本身造成韌帶纖維等的損傷而出現(xiàn)異常的骨化,應(yīng)力刺激亦可造成機(jī)體的應(yīng)激反映而出現(xiàn)局部微環(huán)境的變化,即纖維細(xì)胞等出現(xiàn)異常的蛋白表達(dá),包括一些能誘導(dǎo)纖維細(xì)胞向骨細(xì)胞分化的細(xì)胞因子,如骨形成蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子β、血管生長因子、胰島素樣生長因子I(ISGF-I)等。上述各因子能刺激骨母細(xì)胞DNA合成、毛細(xì)血管侵入,使前膠原蛋白合成增加,在OPLL患者的后縱韌帶細(xì)胞中

7、選擇性誘導(dǎo)成骨分化,在后縱韌帶細(xì)胞上受體數(shù)目增多,進(jìn)而影響膠原在韌帶骨化不同區(qū)域的表達(dá)、骨化進(jìn)展等病理生理過程。然其發(fā)生機(jī)制又是如何?TTW大鼠作為研究后縱韌帶骨化的動物模型,其骨化程度隨鼠齡增長逐漸加重而最終導(dǎo)致大鼠的脊髓直接受壓癱瘓,NPPS基因突變可能與TWY大鼠的骨化進(jìn)展呈直接相關(guān)。人類OPLL進(jìn)展是否與NPPS基因的某些外顯子或內(nèi)含子的核苷酸序列的多態(tài)性變異有關(guān)?影響骨化進(jìn)展的相關(guān)綜合因素有哪些?目前有關(guān)OPLL術(shù)后骨化進(jìn)展與

8、NPPS基因突變之關(guān)系國內(nèi)外未見報道。 目的：綜合分析OPLL患者骨化程度以及骨化術(shù)后進(jìn)展的相關(guān)因素,并通過PCR、SNPs等技術(shù)分析其NPPS基因多態(tài)性與骨化發(fā)生率、骨化程度以及骨化術(shù)后進(jìn)展的相關(guān)性,結(jié)合電鏡掃描結(jié)果了解核苷酸焦磷酸酶影響羥基磷灰石沉積及骨化的具體機(jī)制。從病理免疫組化實驗上了解骨化組織骨化進(jìn)程及成骨細(xì)胞因子與骨化進(jìn)展的關(guān)系。進(jìn)而更加全面了解OPLL的發(fā)生機(jī)制,尤其是骨化程度及骨化進(jìn)展的情況,為臨床診治尤其是OP

9、LL術(shù)后骨化進(jìn)展患者提供確實可行的實驗證據(jù)。 方法： (1)綜合分析與脊柱后縱韌帶骨化程度相關(guān)的因素,收集95例收治的后縱韌帶骨化患者的外周血液和90例的非后縱韌帶骨化患者的外周血液,通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、單核苷酸多態(tài)性(SNPs)方法檢測核苷酸焦磷酸酶基因的四個相關(guān)位點的多態(tài)性；并比較分析OPLL患者骨化發(fā)生率、骨化程度與NPPS基因多態(tài)性的相關(guān)性,結(jié)合電鏡掃描結(jié)果了解NPPS基因影響韌帶骨化的機(jī)制。 (

10、2)分析獲得隨訪的39例脊柱后縱韌帶骨化術(shù)后骨化進(jìn)展患者的相關(guān)資料,測量其骨化進(jìn)展的相關(guān)數(shù)據(jù),分析與OPLL術(shù)后骨化進(jìn)展的相關(guān)影響因素,并分析其與NPPS基因的四個突變位點的相關(guān)性。 (3)通過對手術(shù)獲得的30例頸椎后縱韌帶骨化患者的后縱韌帶骨化標(biāo)本進(jìn)行組織病理學(xué)和免疫組化試驗,比較分析不同骨化類型其骨化的組織病理學(xué)變化情況、骨化的連續(xù)進(jìn)程具體分區(qū)以及成骨細(xì)胞因子在骨化局部分布情況,了解成骨細(xì)胞因子與骨化術(shù)后進(jìn)展的相關(guān)性。

11、 結(jié)果： (1)脊柱后縱韌帶骨化類型與骨化程度即骨化厚度和骨化椎節(jié)數(shù)有一定的相關(guān)性,脊柱后縱韌帶骨化程度與頸3后縱韌帶骨化及胸椎后縱韌帶骨化有一定的相關(guān)性,故頸3后縱韌帶骨化、胸椎后縱韌帶骨化可作為骨化程度的相對指標(biāo)。選擇并檢測NPPS基因以下四個基因突變位點:A533C(exon4,533A→C)、IVS15-14T→C(intron15,-14T→C)、C973T(exon9,973C→T)、IVS20-11delT(in

12、tron20,-11 deletion T)。結(jié)果表明核苷酸焦磷酸酶基因多態(tài)性與脊柱后縱韌帶骨化的發(fā)生率、骨化程度有一定的相關(guān)性。其中骨化的發(fā)生率與NPPS基因IVS15-14T→C位點變化相關(guān)性更為密切,而NPPS基因IVS20-11delT位點變化與脊柱后縱韌帶骨化的程度關(guān)系相對較為密切。在膠原纖維內(nèi)可見散在的由纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來類軟骨樣細(xì)胞以及羥基磷灰石沉積。 (2)影響脊柱后縱韌帶骨化術(shù)后進(jìn)展的影響因素有多方面：手術(shù)方式是

13、影響骨化進(jìn)展的首要因素,前路手術(shù)后骨化進(jìn)展顯著少于后路手術(shù)；其次為伴頸3后縱韌帶骨化；患者年齡是第三因素,年輕的連續(xù)型或混合型骨化患者術(shù)后骨化進(jìn)展度相對較高。NPPS基因多態(tài)性與骨化進(jìn)展有一定的相關(guān)性:NPPS基因內(nèi)含子20上游第11位的T堿基缺失IVS20-11delT(intron20,-11 deletion T)與OPLL術(shù)后骨化進(jìn)展有顯著的相關(guān)性,并且與頸3后縱韌帶骨化相關(guān)密切,其具體的產(chǎn)生機(jī)理尚無法明確,可能與內(nèi)含子的修飾功

14、能有關(guān)。 (3)后縱韌帶骨化病理呈現(xiàn)明顯的連續(xù)進(jìn)程：可分為骨化區(qū)、鈣化軟骨區(qū)、纖維軟骨區(qū)和纖維區(qū)。連續(xù)型骨化與局限型骨化病理略有不同。骨化標(biāo)本免疫組化實驗顯示：在骨化進(jìn)程的各區(qū)域內(nèi)有關(guān)成骨因子如骨形成蛋白2、轉(zhuǎn)化生長因子β、Ⅰ型Ⅱ型膠原以及血管生長因子的表達(dá)重點不同,與骨化發(fā)展過程相關(guān)密切。Ⅰ型膠原主要在骨化區(qū)內(nèi)表達(dá),Ⅱ型膠原及TBFβ主要在鈣化軟骨區(qū)內(nèi)表達(dá),BMP2主要在纖維軟骨區(qū)內(nèi)表達(dá),血管生長因子主要在纖維區(qū)及交界處表達(dá)。

15、OPLL術(shù)后骨化進(jìn)展與局部細(xì)胞因子關(guān)系密切,BMP2與TGF-β協(xié)同作用促進(jìn)骨化進(jìn)展。OPLL患者手術(shù)方式與骨化進(jìn)展有顯著的相關(guān)性。手術(shù)方式選擇需綜合考慮患者的年齡、患者術(shù)前脊髓神經(jīng)功能,而骨化局部因素以及有關(guān)術(shù)后骨化進(jìn)展的相關(guān)因素需綜合考慮。 結(jié)論： (1)脊柱OPLL骨化程度與骨化類型、伴頸3后縱韌帶骨化以及胸椎后縱韌帶骨化相關(guān)密切；脊柱OPLL的發(fā)生率及程度與NPPS基因多態(tài)性有一定的相關(guān)性。 (2)脊柱O