線粒體COX基因單核苷酸多態(tài)性與肝癌發(fā)病風險的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　原發(fā)性肝癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是一種常見的惡性腫瘤，目前在中國致死性腫瘤中肝癌已躍據(jù)第二位，給人民身體素質(zhì)提升和國民經(jīng)濟發(fā)展造成了嚴重威脅。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)線粒體DNA(mitochondria DNA，mtDNA)突變及單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNP)與腫瘤的發(fā)生相關(guān)。但研究范圍多局限于mtDNA非編碼區(qū)，少

2、有涉及mtDNA的編碼區(qū)域。COX片段是位于mtDNA編碼區(qū)的基因，主要負責編碼細胞色素氧化酶（cytochrome oxidase, COX）其中的三個亞基，由于細胞色素氧化酶在線粒體氧化磷酸化過程以及致癌機制中的關(guān)鍵地位，其對應基因區(qū)域的突變和多態(tài)性也可能與腫瘤發(fā)生存在內(nèi)在聯(lián)系。SNP是基因組DNA序列中單個核苷酸變異引起的多態(tài)性，被廣泛應用于多基因疾病的易感基因研究領(lǐng)域。本研究通過對整段COX基因進行DNA擴增、測序，并結(jié)合病例-

3、對照統(tǒng)計學方法，找出與肝細胞癌發(fā)病風險相關(guān)的SNP位點，并分析這些位點SNP與患者臨床特征的關(guān)系，從而進一步揭示COX基因SNP與肝癌發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系，這將對肝癌易患人群的早期篩查和防治工作帶來深遠影響。
　　方法：
　　1.研究對象及標本采集：其中病例組130例肝細胞癌患者均為2007年9月~2008年3月期間于河北醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院肝膽外科住院的病人，術(shù)前均經(jīng)免疫學檢查及影像學方法臨床診斷為原發(fā)性肝癌，且術(shù)后病理并已

4、被證實為肝細胞癌。健康對照組為2008年10月~2009年4月期間河北醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院采集的正常人抗凝靜脈血標本。
　　2.基因組DNA的提取：分離提取肝癌冰凍組織及對照組血樣的基因組DNA（DNA純化試劑盒），提取后置于4℃恒溫冰箱中長期保存?zhèn)溆谩?br>　　3.PCR(polymerase chain reaction)擴增COX基因目的片段：在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找COX基因所包含的基因片段，包含COI、COII和COII

5、I三段，按600bps左右長度將COX基因劃分為9個小基因片段(見Table2)，遵照引物設(shè)計原則對每段小基因片段設(shè)計PCR上下游引物，后使用PCR預混試劑盒進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，放入凝膠成像系統(tǒng)（美國Image公司）證實已擴增出DNA條帶，將擴增產(chǎn)物送至生物工程技術(shù)有限公司（Shanghai）進行測序。
　　4.統(tǒng)計分析：對于計量資料，當n<30例時采用t檢驗（Student's t test）， n≥30例采用

6、u檢驗（u-test）；采用χ2檢驗比較計數(shù)資料，并計算P值。實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05被認為有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.肝癌組與對照組臨床資料對比：年齡、性別在兩組之間無顯著性差異(P>0.05)。
　　2.在肝癌組中隨機選出30例標本 DNA進行擴增、測序，分析后發(fā)現(xiàn)6962G/A、7196C/A、7853G/A、8701A/G、8584G/A、8414C/T、918

7、0A/G、9540T/C、9545A/G九個高頻率多態(tài)性位點（出現(xiàn)頻率>5％）。對以上多態(tài)性位點分布頻率進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，肝癌組9545 A/G的SNP分布頻率與對照組相比有臨界性差異(χ2=5.455， P=0.052)。以上結(jié)果說明，該位點的SNP分布頻率在肝癌發(fā)病風險中具有潛在意義。
　　3.對9545A/G所屬基因片段的病例數(shù)進一步擴大（130例），發(fā)現(xiàn)該點的 SNP在病例組和對照組間的分布頻率有統(tǒng)計學差異（χ2=5.55

8、9， P=0.026）。
　　4.進一步將9545A/G位點SNP分布和肝癌患者的臨床特征進行比較分析，結(jié)果顯示，9545A/G位點SNP與肝癌患者臨床特征，包括性別、年齡、腫瘤長徑、腫瘤數(shù)目、Child分期、臨床分期及門脈瘤栓等均無關(guān)（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.mtDNA編碼區(qū)COX基因上的9545A/G位點SNP與肝癌發(fā)病風險相關(guān)，該位點SNP可能增加了肝癌的發(fā)病風險。
　　2.COX基因的954