線粒體COX基因單核苷酸多態(tài)性與肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　原發(fā)性肝癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，目前在中國(guó)致死性腫瘤中肝癌已躍據(jù)第二位，給人民身體素質(zhì)提升和國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成了嚴(yán)重威脅。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)線粒體DNA(mitochondria DNA，mtDNA)突變及單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNP)與腫瘤的發(fā)生相關(guān)。但研究范圍多局限于mtDNA非編碼區(qū)，少

2、有涉及mtDNA的編碼區(qū)域。COX片段是位于mtDNA編碼區(qū)的基因，主要負(fù)責(zé)編碼細(xì)胞色素氧化酶（cytochrome oxidase, COX）其中的三個(gè)亞基，由于細(xì)胞色素氧化酶在線粒體氧化磷酸化過(guò)程以及致癌機(jī)制中的關(guān)鍵地位，其對(duì)應(yīng)基因區(qū)域的突變和多態(tài)性也可能與腫瘤發(fā)生存在內(nèi)在聯(lián)系。SNP是基因組DNA序列中單個(gè)核苷酸變異引起的多態(tài)性，被廣泛應(yīng)用于多基因疾病的易感基因研究領(lǐng)域。本研究通過(guò)對(duì)整段COX基因進(jìn)行DNA擴(kuò)增、測(cè)序，并結(jié)合病例-

3、對(duì)照統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，找出與肝細(xì)胞癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的SNP位點(diǎn)，并分析這些位點(diǎn)SNP與患者臨床特征的關(guān)系，從而進(jìn)一步揭示COX基因SNP與肝癌發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系，這將對(duì)肝癌易患人群的早期篩查和防治工作帶來(lái)深遠(yuǎn)影響。
　　方法：
　　1.研究對(duì)象及標(biāo)本采集：其中病例組130例肝細(xì)胞癌患者均為2007年9月~2008年3月期間于河北醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院肝膽外科住院的病人，術(shù)前均經(jīng)免疫學(xué)檢查及影像學(xué)方法臨床診斷為原發(fā)性肝癌，且術(shù)后病理并已

4、被證實(shí)為肝細(xì)胞癌。健康對(duì)照組為2008年10月~2009年4月期間河北醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院采集的正常人抗凝靜脈血標(biāo)本。
　　2.基因組DNA的提?。悍蛛x提取肝癌冰凍組織及對(duì)照組血樣的基因組DNA（DNA純化試劑盒），提取后置于4℃恒溫冰箱中長(zhǎng)期保存?zhèn)溆谩?br>　　3.PCR(polymerase chain reaction)擴(kuò)增COX基因目的片段：在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查找COX基因所包含的基因片段，包含COI、COII和COII

5、I三段，按600bps左右長(zhǎng)度將COX基因劃分為9個(gè)小基因片段(見(jiàn)Table2)，遵照引物設(shè)計(jì)原則對(duì)每段小基因片段設(shè)計(jì)PCR上下游引物，后使用PCR預(yù)混試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，放入凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Image公司）證實(shí)已擴(kuò)增出DNA條帶，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至生物工程技術(shù)有限公司（Shanghai）進(jìn)行測(cè)序。
　　4.統(tǒng)計(jì)分析：對(duì)于計(jì)量資料，當(dāng)n<30例時(shí)采用t檢驗(yàn)（Student's t test）， n≥30例采用

6、u檢驗(yàn)（u-test）；采用χ2檢驗(yàn)比較計(jì)數(shù)資料，并計(jì)算P值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.肝癌組與對(duì)照組臨床資料對(duì)比：年齡、性別在兩組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
　　2.在肝癌組中隨機(jī)選出30例標(biāo)本 DNA進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，分析后發(fā)現(xiàn)6962G/A、7196C/A、7853G/A、8701A/G、8584G/A、8414C/T、918

7、0A/G、9540T/C、9545A/G九個(gè)高頻率多態(tài)性位點(diǎn)（出現(xiàn)頻率>5％）。對(duì)以上多態(tài)性位點(diǎn)分布頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，肝癌組9545 A/G的SNP分布頻率與對(duì)照組相比有臨界性差異(χ2=5.455， P=0.052)。以上結(jié)果說(shuō)明，該位點(diǎn)的SNP分布頻率在肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)中具有潛在意義。
　　3.對(duì)9545A/G所屬基因片段的病例數(shù)進(jìn)一步擴(kuò)大（130例），發(fā)現(xiàn)該點(diǎn)的 SNP在病例組和對(duì)照組間的分布頻率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=5.55

8、9， P=0.026）。
　　4.進(jìn)一步將9545A/G位點(diǎn)SNP分布和肝癌患者的臨床特征進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示，9545A/G位點(diǎn)SNP與肝癌患者臨床特征，包括性別、年齡、腫瘤長(zhǎng)徑、腫瘤數(shù)目、Child分期、臨床分期及門脈瘤栓等均無(wú)關(guān)（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.mtDNA編碼區(qū)COX基因上的9545A/G位點(diǎn)SNP與肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，該位點(diǎn)SNP可能增加了肝癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
　　2.COX基因的954