鼠抗人B7-H4單克隆抗體功能研究及鼠抗人B7-H4受體單克隆抗體的制備.pdf

1、B7家族是最重要的共刺激分子，在調節(jié)T細胞的活化和免疫耐受的動態(tài)平衡中起重要調節(jié)功能。B7-H4（B7X，B7S1），是B7家族的新成員之一。人的B7-H4基因含有5個內含子和6個外顯子，位于人染色體的1p11.1。B7-H4與B7家族其他分子一樣，高表達于多種腫瘤組織，例如肺癌，乳腺癌，卵巢癌，胃癌等，而在正常人體組織中卻低表達或不表達，這使得B7-H4有望成為一種新的腫瘤標志物。另外，B7-H4作為負性刺激因子，當與其受體結合后，抑

2、制T細胞的增殖、活化和細胞因子的分泌，可以推測B7-H4在腫瘤細胞逃避機體的免疫監(jiān)視和維持機體的免疫耐受過程中發(fā)揮重要作用。然而同樣對T細胞信號通路有影響的B7-H4受體還沒有被克隆出來，對其報道也不是很多，對于受體的研究有助于我們進一步了解B7-H4在腫瘤組織中的作用機制，并有望成為腫瘤免疫治療的新靶點。
　　本課題通過構建乳腺癌細胞株MCF-7與急性T淋巴細胞白血病Jurkat細胞株共培養(yǎng)體系，模擬體內腫瘤環(huán)境，用本科室已制備

3、的鼠抗人B7-H4單克隆抗體5C8阻斷MCF-7細胞株上B7-H4分子，抑制B7-H4分子負性調控作用，共培養(yǎng)后檢測Jurkat細胞生物學特性的改變。
　　在炎癥浸潤的人扁桃體部分淋巴細胞中檢測到B7-H4受體的表達，并以此為免疫原，制備鼠抗人B7-H4受體的單克隆抗體。
　　一、鼠抗人B7-H4單克隆抗體功能研究
　　【目的】構建共培養(yǎng)體系，研究B7-H4對Jurkat細胞生物學功能的改變。
　　【方法】流式細

4、胞儀技術檢測MCF-7細胞B7-H4的表達和Jurkat細胞上B7-H4受體表達，將兩細胞共培養(yǎng)72h，收集與MCF-7貼在一起的Jurkat細胞，對其表面CD3、CD69分子表達通過流式細胞技術進行檢測，并采用CCK8法對Jurkat的增殖情況進行檢測。
　　【結果】MCF-7細胞表面的B7-H4分子能夠作用于Jurkat細胞株，促使其細胞表面CD3、CD69分子下調表達，抑制Jurkat細胞增殖。加入B7-H4單克隆抗體5C8

5、共培養(yǎng)后，Jurkat細胞上分子表達和增殖情況則恢復。
　　【結論】B7-H4是一種負性共刺激分子，能夠抑制T細胞的增殖和膜分子的表達。
　　二、鼠抗人B7-H4受體單克隆抗體的制備
　　【目的】鼠抗人B7-H4受體單克隆抗體制備，并對其生物學功能進行檢測。
　　【方法】以炎癥浸潤的扁桃體細胞分選出的淋巴細胞作為免疫原，免疫6-8周齡的BALB/c小鼠。取脾臟研磨，與小鼠骨髓瘤細胞株SP2.0融合為雜交瘤株。采用

6、流式細胞技術對雜交瘤株上清進行檢測，篩選出陽性雜交瘤株。以B7-H4-mFc-FITC為基礎，通過位點競爭抑制實驗進一步篩選。將本科室B7-H4受體洗脫蛋白包板后，采用ELISA法對雜交瘤株進一步篩選。對初步確定的雜交瘤株用快速試紙法測定亞型。
　　【結果】篩選出兩株疑似的B7-H4受體單克隆抗體命名為3B2和2E2。經位點競爭和ELISA法初步鑒定，3B2比2E2效果稍好，并測定兩株抗體的亞型均為IgG2a類。
　　【結論