鼠抗人B7-H4單克隆抗體功能研究及鼠抗人B7-H4受體單克隆抗體的制備.pdf

1、B7家族是最重要的共刺激分子，在調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化和免疫耐受的動(dòng)態(tài)平衡中起重要調(diào)節(jié)功能。B7-H4（B7X，B7S1），是B7家族的新成員之一。人的B7-H4基因含有5個(gè)內(nèi)含子和6個(gè)外顯子，位于人染色體的1p11.1。B7-H4與B7家族其他分子一樣，高表達(dá)于多種腫瘤組織，例如肺癌，乳腺癌，卵巢癌，胃癌等，而在正常人體組織中卻低表達(dá)或不表達(dá)，這使得B7-H4有望成為一種新的腫瘤標(biāo)志物。另外，B7-H4作為負(fù)性刺激因子，當(dāng)與其受體結(jié)合后，抑

2、制T細(xì)胞的增殖、活化和細(xì)胞因子的分泌，可以推測(cè)B7-H4在腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和維持機(jī)體的免疫耐受過(guò)程中發(fā)揮重要作用。然而同樣對(duì)T細(xì)胞信號(hào)通路有影響的B7-H4受體還沒有被克隆出來(lái)，對(duì)其報(bào)道也不是很多，對(duì)于受體的研究有助于我們進(jìn)一步了解B7-H4在腫瘤組織中的作用機(jī)制，并有望成為腫瘤免疫治療的新靶點(diǎn)。
　　本課題通過(guò)構(gòu)建乳腺癌細(xì)胞株MCF-7與急性T淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞株共培養(yǎng)體系，模擬體內(nèi)腫瘤環(huán)境，用本科室已制備

3、的鼠抗人B7-H4單克隆抗體5C8阻斷MCF-7細(xì)胞株上B7-H4分子，抑制B7-H4分子負(fù)性調(diào)控作用，共培養(yǎng)后檢測(cè)Jurkat細(xì)胞生物學(xué)特性的改變。
　　在炎癥浸潤(rùn)的人扁桃體部分淋巴細(xì)胞中檢測(cè)到B7-H4受體的表達(dá)，并以此為免疫原，制備鼠抗人B7-H4受體的單克隆抗體。
　　一、鼠抗人B7-H4單克隆抗體功能研究
　　【目的】構(gòu)建共培養(yǎng)體系，研究B7-H4對(duì)Jurkat細(xì)胞生物學(xué)功能的改變。
　　【方法】流式細(xì)

4、胞儀技術(shù)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞B7-H4的表達(dá)和Jurkat細(xì)胞上B7-H4受體表達(dá)，將兩細(xì)胞共培養(yǎng)72h，收集與MCF-7貼在一起的Jurkat細(xì)胞，對(duì)其表面CD3、CD69分子表達(dá)通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，并采用CCK8法對(duì)Jurkat的增殖情況進(jìn)行檢測(cè)。
　　【結(jié)果】MCF-7細(xì)胞表面的B7-H4分子能夠作用于Jurkat細(xì)胞株，促使其細(xì)胞表面CD3、CD69分子下調(diào)表達(dá)，抑制Jurkat細(xì)胞增殖。加入B7-H4單克隆抗體5C8

5、共培養(yǎng)后，Jurkat細(xì)胞上分子表達(dá)和增殖情況則恢復(fù)。
　　【結(jié)論】B7-H4是一種負(fù)性共刺激分子，能夠抑制T細(xì)胞的增殖和膜分子的表達(dá)。
　　二、鼠抗人B7-H4受體單克隆抗體的制備
　　【目的】鼠抗人B7-H4受體單克隆抗體制備，并對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行檢測(cè)。
　　【方法】以炎癥浸潤(rùn)的扁桃體細(xì)胞分選出的淋巴細(xì)胞作為免疫原，免疫6-8周齡的BALB/c小鼠。取脾臟研磨，與小鼠骨髓瘤細(xì)胞株SP2.0融合為雜交瘤株。采用

6、流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)雜交瘤株上清進(jìn)行檢測(cè)，篩選出陽(yáng)性雜交瘤株。以B7-H4-mFc-FITC為基礎(chǔ)，通過(guò)位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步篩選。將本科室B7-H4受體洗脫蛋白包板后，采用ELISA法對(duì)雜交瘤株進(jìn)一步篩選。對(duì)初步確定的雜交瘤株用快速試紙法測(cè)定亞型。
　　【結(jié)果】篩選出兩株疑似的B7-H4受體單克隆抗體命名為3B2和2E2。經(jīng)位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)和ELISA法初步鑒定，3B2比2E2效果稍好，并測(cè)定兩株抗體的亞型均為IgG2a類。
　　【結(jié)論