膽汁酸對胰腺腺泡細(xì)胞的損傷與大黃素調(diào)節(jié)作用的實驗研究.pdf

1、背景與目的：急性胰腺炎（AP）的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸是當(dāng)今外科領(lǐng)域研究的熱點，其發(fā)病機(jī)理尚未完全闡明。其中急性膽源性胰腺炎（ABP）在我國發(fā)病率最高，占AP總數(shù)的50-80%。目前普遍認(rèn)為，ABP是由于膽管炎癥、結(jié)石、寄生蟲、水腫、痙攣等病變使壺腹部發(fā)生梗阻，加之膽囊收縮，膽管內(nèi)壓力升高，膽汁通過共同通道反流入胰管，激活胰酶原，導(dǎo)致胰腺自身消化而引起胰腺炎。但其確切的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。可以認(rèn)為，隨膽汁異常反流入胰管的膽汁酸，造成胰腺腺泡

2、細(xì)胞功能與結(jié)構(gòu)損害是大多數(shù)ABP發(fā)病的一個關(guān)鍵性因素。因此，本研究探討膽汁酸7種不同成分對胰腺腺泡細(xì)胞的損傷作用，檢測在各種膽汁酸作用下胰腺腺泡細(xì)胞的存活率，凋亡/壞死的改變，觀察對腺泡細(xì)胞分泌功能的影響，并探究細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性的變化，研究大黃素對膽汁酸誘導(dǎo)的胰腺腺泡細(xì)胞損傷的保護(hù)性作用；同時，進(jìn)一步揭示急性膽源性胰腺炎大鼠發(fā)病中，膽汁酸對胰腺的損傷性作用及其機(jī)制，觀察中藥清胰湯的治療作用，為揭示急性膽源性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制

3、和尋求更為有效的防治措施提供新的實驗佐證。 方法： 實驗一：以大鼠AR42J胰腺腺泡細(xì)胞系為研究對象，應(yīng)用MTT方法檢測7種不同膽汁酸對細(xì)胞存活率的影響和劑量與時間依賴性關(guān)系，采用光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變與凋亡/壞死的變化，流式細(xì)胞術(shù)AV/PI雙染法檢測細(xì)胞的凋亡/壞死率。細(xì)胞經(jīng)0．4mM DCA作用15min，30min，1h，4h后分別收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清檢測淀粉酶活性，提取細(xì)胞漿和細(xì)胞核蛋白，分別檢測

4、各組細(xì)胞漿淀粉酶的活性，利用Luminex檢測40種細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子（TF）的DNA結(jié)合活性的變化。 實驗二：大黃素（Emodin）是治療急性胰腺炎中藥方劑的一種主藥，通過體外實驗觀察其對膽汁酸誘導(dǎo)的胰腺腺泡細(xì)胞損傷的保護(hù)性作用和影響。以大鼠AR42J胰腺腺泡系為研究對象，分為三組，分別為CON組，0．4mM DCA刺激組和0．4mM DCA+Emodin（20μM）干預(yù)組，利用流式細(xì)胞術(shù)AV/PI雙染法檢測各組細(xì)胞凋亡/壞死率，

5、以上各組進(jìn)一步按照不同時間點分為4組：15min，30min，1h和4h，于相應(yīng)時間點分別收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清檢測淀粉酶活性，提取細(xì)胞漿和細(xì)胞核蛋白，分別檢測各組細(xì)胞漿淀粉酶的活性，利用Luminex檢測40種細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子（TF）的DNA結(jié)合活性的變化。 實驗三：經(jīng)膽胰管逆行注入不同濃度去氧膽酸鈉制備大鼠急性水腫性胰腺炎（AEP）和急性壞死性胰腺炎（ANP）模型。40只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、AEP組、ANP組及對ANP的清胰

6、湯治療組（1ml/100g），每組10只。治療組大鼠于造模后立即一次和造模后12h再次給藥。24h后采取標(biāo)本做病理檢查和各項指標(biāo)檢測。光鏡下觀察各組胰腺標(biāo)本病理改變，進(jìn)行組織學(xué)評分；采用TUNEL技術(shù)檢測胰腺腺泡細(xì)胞的凋亡，計算凋亡指數(shù)；應(yīng)用分光光度法檢測凋亡蛋白酶Caspase-3，8和9的活性變化。 結(jié)果：膽汁酸7中主要成分對胰腺腺泡細(xì)胞的損傷作用不同，其中DCA，CDCA，LCA和TDCA4種膽汁酸細(xì)胞毒作用明顯，呈劑量和

7、時間依賴性誘導(dǎo)腺泡細(xì)胞凋亡和壞死，CA，GCA和GDCA則不具有細(xì)胞毒作用。膽汁酸DCA和CA對腺泡細(xì)胞淀粉酶的合成與分泌功能均沒有顯著影響，在檢測的40種核轉(zhuǎn)錄因子（TF）的DNA結(jié)合活性中，DCA誘導(dǎo)AR42J胰腺腺泡細(xì)胞核內(nèi)ATF2，AR33，STAT5，NFAT，F(xiàn)KHR和NKX-2．5這6種核轉(zhuǎn)錄因子（TF）的DNA結(jié)合活性顯著升高，而RUNX/AML，NF-Y，MEF2和E2F1這4種TF的DNA結(jié)合活性則明顯下降，其余30

8、種TF活性沒有明顯變化。 20μM Emodin可以減少DCA誘導(dǎo)的AR42J胰腺腺泡細(xì)胞的凋亡與壞死，對細(xì)胞淀粉酶的合成與分泌功能沒有明顯影響，同DCA誘導(dǎo)的TF活性變化相比，Emodin升高PAX3，E2F1，RUNX/AML，NF-Y，IRF，MEF和NFAT這5種TF活性，降低FKHR的活性。 大鼠體內(nèi)實驗結(jié)果表明，AEP組與ANP組腺泡細(xì)胞凋亡指數(shù)、Caspase-3，8和9的活性均顯著高于假手術(shù)組，且AEP組

9、腺泡細(xì)胞凋亡指數(shù)及凋亡蛋白酶的活性水平顯著高于ANP組。同時，AEP組與ANP組病理組織學(xué)評分、血清淀粉酶、血清促炎性細(xì)胞因子等指標(biāo)均較假手術(shù)組顯著升高，且ANP組顯著高于AEP組。清胰湯通過誘導(dǎo)凋亡蛋白酶活性升高使ANP組大鼠胰腺腺泡細(xì)胞凋亡增多而壞死減輕，從而減輕胰腺組織損害和炎癥因子水平。 結(jié)論：膽汁酸主要的7種成分中，DCA，CDCA，LCA和TDCA在0．3-0．4mM的較低濃度，在24h內(nèi)可導(dǎo)致大鼠AR42J胰腺腺泡

10、細(xì)胞存活率顯著下降，這種細(xì)胞毒作用呈時間和劑量依賴性關(guān)系，而CA，GCA和GDCA這3種膽汁酸則在1．0mM濃度內(nèi)不會損傷腺泡細(xì)胞。膽汁酸對腺泡細(xì)胞的損傷作用主要表現(xiàn)為凋亡和壞死，對細(xì)胞內(nèi)酶的合成和分泌功能沒有明顯影響。研究發(fā)現(xiàn)，DCA可誘導(dǎo)細(xì)胞6種TF的DNA結(jié)合活性顯著升高和4種TF的DNA結(jié)合活性顯著下降，從而影響相關(guān)基因的表達(dá)水平，是其造成細(xì)胞損傷的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。因此，本研究為膽汁酸誘導(dǎo)的胰腺腺泡細(xì)胞損傷提供有力的實驗依據(jù)，并

11、揭示了膽汁酸7種不同成分的作用特點和可能機(jī)制，將為探討膽源性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制和防治措施提供參考。 Emodin對膽汁酸誘導(dǎo)的胰腺腺泡細(xì)胞損傷有一定的保護(hù)性作用，對細(xì)胞淀粉酶的合成與分泌功能沒有明顯影響。通過調(diào)節(jié)細(xì)胞TF的DNA結(jié)合活性，從而改變相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)．可能是其發(fā)揮保護(hù)性作用的分子機(jī)制。 急性膽源性胰腺炎時，膽汁酸誘導(dǎo)的胰腺腺泡細(xì)胞損傷時疾病發(fā)生的重要因素，腺泡細(xì)胞損傷主要表現(xiàn)為凋亡和壞死，且凋亡的多少與病