ART子代三核苷酸重復動態(tài)突變的研究.pdf

1、自1978年首例體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，ⅣF-ET)嬰兒路易斯·布朗出生，人類輔助生殖技術(shù)(assisted roductive technology，ART)發(fā)展迅速，誕生了包括卵巢刺激(Ovrian stimulation，OS)、單精子卵細胞漿內(nèi)注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)、植入前遺傳學診斷(preimp

2、lantation genehic diagnosis，PGD)、未成熟卵體外培養(yǎng)(in vitro maturation，ⅣM)等一系列衍生技術(shù)，已出生了約3，000，000的ART子代，而這些人已構(gòu)成一個新的重要人群。已有報道顯示ART治療過程中的配子和胚胎操作可能與子代自然流產(chǎn)、低體重、極低體重、小于胎齡兒、出生缺陷、腦癱、印跡缺陷的發(fā)生有關。一些研究小組已經(jīng)證實了ART子代在核型異常發(fā)生率上風險確實有所增加。后來也有報道發(fā)現(xiàn)IV

3、F/ICSI的男性孩子新發(fā)Y染色體微缺失的發(fā)生率比正常的孩子要高。
　　 但是，關于ART與新發(fā)的遺傳突變之間的聯(lián)系目前還有很大的爭議。Caperton和他的同事使用一個轉(zhuǎn)基因的小鼠模型來檢驗懷孕過程中ART對點突變的頻率和光譜的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ART組和自然對照組之間并沒顯著性差異。除此之外，2009年Riccaboni小組的一項研究揭示了ART子代中囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)因子基因(cystic fibrosis transme

4、mbrane conductance regulator gene，CFTR)的突變頻率與一般人群差不多。
　　 在20世紀90年代，14種神經(jīng)障礙疾病被發(fā)現(xiàn)是由于基因的編碼區(qū)或者調(diào)節(jié)區(qū)的三核苷酸重復序列的擴增引起的。這種類型的DNA改變被稱為動態(tài)突變。一個位點發(fā)生一個新發(fā)突變的頻率是10，000-1，000，000之一。相比其它基因位點，上下代之間動態(tài)突變位點的突變發(fā)生率要高得多，是分析DNA的穩(wěn)定性的一個相對敏感的指標。它表

5、現(xiàn)為一些特殊基因有絲分裂和減數(shù)分裂時的三核苷酸重復的不穩(wěn)定地擴增或者縮減。上下代之間同一動態(tài)突變部位的重復序列拷貝數(shù)可以是不同的。正常人該重復序列拷貝數(shù)通常限定在一個較小的范圍內(nèi)，上下代之間的拷貝數(shù)變化頻率和幅度較小，變化的形式既可是擴增，也可是縮減。超過這個范圍，個體本人表型正常，但重復序列將變得不穩(wěn)定，后代重復序列數(shù)目很可能進一步增加。當重復序列拷貝數(shù)繼續(xù)增加突破某一水平后，個體表現(xiàn)出現(xiàn)表型變化，便成為患者。
　　 研究目的

6、：
　　 調(diào)查ART出生兒動態(tài)突變的發(fā)生頻率，比較其與自然妊娠出生兒之間的差異，探討ART對動態(tài)突變基因三核苷酸重復拷貝數(shù)突變頻率和幅度的影響，為ART對DNA穩(wěn)定性的效應研究提供證據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 以齒狀核紅核蒼白球丘腦下部核萎縮(dentatoubral and pallidoluysian atrophy，DRPLA)，脊髓延髓肌萎縮(spinal and bular muscular atr

7、ophy，SBMA)，脊髓小腦共濟失調(diào)Ⅰ型(spinocerebellar ataxia，SCA1)，馬赫多-約瑟夫病(machado-joseph，MJD)，亨廷頓病(huntington's disease gene，HD)，肌強直性肌萎縮(myotonic dystrophy，DM)，脆性X綜合征(fragile X syndrome，F(xiàn)raX)7種動態(tài)突變疾病的致病基因：ATN1，AR，ATXN1，ATXN3，Huntingto

8、n，DMPK，F(xiàn)MR-1基因為目的基因。
　　 收集在浙江大學醫(yī)學院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院完成分娩的ART家系61例，其中包括45例IVF家系和16例ICSI家系。同時收集在該院完成分娩的60例數(shù)自然妊娠家系，作為正常對照。采集嬰兒的臍帶血和父母親的靜脈血，提取DNA。
　　 應用TaKaRa LA Taq DNA聚合酶配合GC buffer進行PCR擴增上述7個基因的三核苷酸重復序列的目的片段，瓊脂糖凝膠電泳，8％非變性聚丙烯

9、酰胺凝膠電泳、DNA的測序分析完成各家系各基因位點三核苷酸重復拷貝數(shù)檢測，統(tǒng)計分析，比較各組間三核苷酸重復序列動態(tài)突變頻率和拷貝數(shù)改變的幅度。
　　 結(jié)果：
　　 61例ART子代中發(fā)現(xiàn)19例(31.15％)發(fā)生了動態(tài)突變，其中45例IVF子代中17例(37.78％)，16例ICSI子代中2例(12.50％)。與對照組家系60例中的(23.33％)相比，沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學上的差異(P>0.05)。在所有的這些被檢測家系中，各

10、動態(tài)突變位點的三核苷酸重復拷貝數(shù)既有增加，也有減少，但均在其正常范圍內(nèi)。ART組和自然對照組的三核苷酸重復拷貝數(shù)改變值中位數(shù)均為3.00(1.00～8.00)，無統(tǒng)計學意義上的顯著性差異(P>0.05)。
　　 在ART家系中，經(jīng)IVF出生的嬰兒的家系的動態(tài)發(fā)生率是17/45，而在ICSI出生的嬰兒的家系中則是2/16，也是沒有明顯的統(tǒng)計學差異。
　　 結(jié)論：
　　 (1)ART技術(shù)，包括單精子顯微注射，對三核苷