Cre-loxP位點特異性重組酶系統(tǒng)聯(lián)合SV40LTAg誘導人黑素細胞可逆性永生化.pdf

1、白癜風是一種常見的后天性局部脫色素性皮膚病，據(jù)國內(nèi)外統(tǒng)計其發(fā)病率約為0.5～2％，且有逐年增高趨勢。白癜風的病因和發(fā)病機制尚未明確，病理表現(xiàn)為皮損局部表皮和毛囊中的黑素細胞(melanocytes，MC)減少或缺失，從而使黑素合成減少或缺失，臨床表現(xiàn)為境界清楚的色素脫失斑。近年來，國外學者研究表明，白癜風患者皮損局部和全身均可檢測到針對MC表面抗原的自身抗體和細胞毒性CD8+T細胞，認為白癜風是一種自身免疫性脫色素性皮膚病。白癜風的治療

2、比較困難，目前有很多治療方法，主要包括光化學治療、內(nèi)服藥物治療、外用藥物治療以及外科治療，前三種治療方法都存在療效個體差異大、副作用大等不足，外科治療主要包括自體表皮移植、自體MC移植和異體MC移植等方法，其中自體MC移植是療效最肯定、副作用最小的方法，因而外科治療已經(jīng)成為白癜風治療研究的熱點。 目前臨床應用于移植治療的MC主要來源于患者自身正常皮膚分離的MC體外培養(yǎng)。成人表皮中MC含量極少，只占表皮細胞的2％左右，正常情況下體

3、外培養(yǎng)的MC生長緩慢、增殖能力極為有限，常需使用促MC生長因子如經(jīng)典的霍亂毒素(choleratoxin，CT)、十四烷酰佛波醇乙酯(12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate，TPA)以及近年逐漸被重視的堿性成纖維細胞生長因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、氫化可的松、牛垂體提取物等。我們應用黑素細胞專用培養(yǎng)基M254及添加劑HMGS(包含TPA、bFGF、

4、轉(zhuǎn)鐵蛋白、氫化可的松和牛垂體提取物等)，進行成人正常表皮MC的分離與培養(yǎng)，經(jīng)系列生物學鑒定細胞表型和生物學功能正常，同時觀察到MC體外傳代最多不超過10代，能得到的MC數(shù)量有限，遠不能滿足臨床移植治療所需，極大地限制了MC移植治療的臨床應用。因此，MC的來源已經(jīng)成為白癜風及其它脫色素性皮膚病外科治療發(fā)展的瓶頸，需要積極探索MC體外大量培養(yǎng)的有效方法和途徑，為自體MC移植提供安全、有效且可大量反復使用的移植供體。 組織工程學的原理

5、是利用人工的功能性組織替代功能障礙的器官或組織，其中，細胞移植尤其是自體細胞移植是目前應用較廣泛的方法。我們設(shè)想如果能利用組織工程學的原理和方法在體外建立白癜風患者的自體MC庫，得到在體外可大量增殖的自體MC，則可能解決白癜風MC移植的細胞來源。常用的誘導細胞永生化的方法有原代培養(yǎng)細胞自發(fā)永生化、端粒酶亞單位hTERT誘導細胞永生化和轉(zhuǎn)基因技術(shù)誘導細胞永生化。通過比較上述方法的利弊，我們選擇利用外源SV40TAg基因誘導細胞永生化。為了

6、避免SV40TAg中stAg(smalltantigen)既可誘導細胞轉(zhuǎn)化也可誘導細胞凋亡的雙重作用，我們用SOE法成功亞克隆出切除內(nèi)含子(編碼stAg)的SV40LTAg(largeTantigen)基因全長，并在其兩端連接兩個同向的loxP序列，構(gòu)建了細胞永生化載體SV40LTAg-EGFP-loxP-reo。利用SofastTM基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將外源的SV40LTAg基因?qū)肱囵B(yǎng)的原代MC中，使外源基因穩(wěn)定整合并表達而獲得永生化黑素

7、細胞系(MCT)，在體外可長期穩(wěn)定傳代(現(xiàn)已傳至45代)。對傳至第30代的MCT-5進行了細胞生物學性狀及功能的鑒定、SV40LTAg基因的整合與表達及致瘤性分析，結(jié)果表明MCT-5(P30)穩(wěn)定整合并表達SV40LTAg，具有與正常原代MC大部分相似的生物學功能和細胞表型。 由于導入的是外源性的原癌基因SV40LTAg，可能使細胞的一些生物學性狀發(fā)生改變，我們的研究結(jié)果表明MCT具有一定的懸浮生長能力，說明MCT具有了一些原代

8、細胞所不具備的轉(zhuǎn)化細胞表型，雖然經(jīng)染色體分析和裸鼠實驗觀察細胞并無致瘤性，但其生物學安全性也受到一定質(zhì)疑。因此，我們利用基因打靶技術(shù)原理，引入位點特異性重組酶系統(tǒng)，去除導入的外源基因SV40LTAg。Cre/loxP位點特異性重組酶系統(tǒng)是由屬于Int家族的Cre位點特異性重組酶和其特定作用位點loxP構(gòu)成，此系統(tǒng)具有高度保守性和特異性，能定時、定位地根據(jù)loxP位點的位置切除特定基因。我們用Lipofectamine2000將pQCXI

9、P-NLS-iCre-ERTT2逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染包裝細胞PA317，Puro選擇培養(yǎng)獲得PA317-Cre單克隆，經(jīng)NIH3T3測定病毒滴度為1×104CFU/ml(Puro抗性)。用此病毒上清感染MCT(感染細胞命名為MCT-C)，經(jīng)Puro篩選和tamoxifen誘導Cre重組酶表達，根據(jù)其作用靶點loxP，切除兩個同向loxP位點之間的SV40LTAg-EGFP基因，分別對Cre重組酶作用第6天和第10天的MCT-C進行PCR、

10、RT-PCR、Westernblotting及免疫組化檢測，結(jié)果表明Cre重組酶的切除效率隨作用時間延長而增加，到第10天時，已檢測不到SV40LTAg基因的表達，切除率可達100％。經(jīng)生物學鑒定和致瘤性分析表明，MCT-C經(jīng)Cre酶根據(jù)loxP位點發(fā)生重組后，細胞表型完全恢復原代細胞表型，具有正常的黑素合成功能，無致瘤性和懸浮生長能力。 為了進一步觀察所建立的可逆性永生化MC(MCT-C)的在體存活率和復色效果，我們選擇豚鼠用

11、過氧化氫化學脫色法建立白癜風動物模型，進行了MCT-C和原代MC的細胞移植實驗，按照白癜風MC移植方法，在建立的白癜風動物模型上誘發(fā)表皮內(nèi)水皰，進行細胞移植，觀察MCT-C和MC移植后的存活率及復色效果。為避免人源性MC可能作為抗原刺激豚鼠產(chǎn)生排斥反應導致移植失敗，同時用裸鼠進行了相同條件的MCT-C和原代MC移植實驗。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MCT-C和原代MC移植2周內(nèi)可見局部輕微炎癥反應，3周后可消失，1個月后移植區(qū)可見色素沉著，連續(xù)觀察3

12、個月后，大部分移植區(qū)可見0.5～1cm的黑色斑片或褐色斑片，經(jīng)統(tǒng)計學檢驗分析，MCT-C和原代MC移植成功率以及豚鼠和裸鼠移植成功率之間無顯著差異。病理觀察及Masson-Fontana黑素銀染色法結(jié)果可見移植區(qū)有散在MC和明顯黑素沉積，表明所建立的可逆性永生化MCT-C與原代MC具有相似的在體存活率及復色效果。 綜上所述，我們的研究結(jié)果表明用Cre/loxP系統(tǒng)聯(lián)合SV40LTAg可以成功地建立人源性、體外可大量增殖、具備正常