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文檔簡介
1、目的:運用piggyBac system篩選在干細胞中能啟動基因表達的高效啟動子,選擇合適的啟動子應用于猿腎病毒40大T抗原(SV40Tag)基因的表達,建立永生化的人尿源性干細胞(urine derived stem cell,USC)。通過對永生化尿源性干細胞的生物學鑒定,明確其干細胞分化潛能,并通過骨形成蛋白(BMP9)誘導分化,進一步明確永生化尿源性干細胞具有多向分化潛能,為組織工程學及再生醫(yī)學提供新型的穩(wěn)定的細胞來源。
2、 方法:運用piggyBac轉座酶系統(tǒng)構建并比較帶有不同啟動子的質粒,用紅色熒光蛋白(RFP)和螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase Fluc)作為報告基因,通過脂質體轉染的方法建立穩(wěn)定表達的細胞系。通過RFP表達強度,F(xiàn)luc定量檢測及流式細胞技術,篩選在干細胞中穩(wěn)定高效表達的啟動子。利用該啟動子構建帶SV40Tag基因表達的質粒,將SV40Tag基因質粒及轉座酶質粒(transposase)共轉染至臨床分離的人尿源
3、性干細胞中。潮霉素(Hygromycin)篩選后陽性細胞克隆并連續(xù)傳代,觀察細胞形態(tài)學以及增殖情況,RT-PCR,免疫熒光等檢測轉染細胞的生物學特性,細胞裸鼠皮下注射檢測其安全性。運用BMP9誘導成骨分化,通過體外細胞堿性磷酸酶(ALP)染色、茜素紅染色(Alizarin-S staining)、油紅O(Oil-red staining)染色、微團細胞培養(yǎng)(Micro Mass)等特異性染色檢測其成骨、成軟骨及成脂分化。體內(nèi)實驗進一步利
4、用Micro-CT,病理切片染色等檢測尿源性干細胞在BMP9誘導下具有多向分化功能。
結果:通過RFP熒光顯示,F(xiàn)luc及流式細胞定量檢測,hEFH啟動子在干細胞系中表達外源基因能力明顯強于其他啟動子,運用hEFH啟動SV40Tag基因在尿源性干細胞中表達,篩選獲得的陽性克隆擴大培養(yǎng),即永生化尿源性干細胞(immorterlized urine derived stem cell,iUSC),增殖能力強,能連續(xù)傳代培養(yǎng)。RT-
5、PCR證實iUSC表達SV40Tag基因,而用翻轉重組酶(Flippers recombination enzyme Flp)處理iUSC可敲除RFT-SV40Tag基因而逆轉永生化。應用免疫熒光細胞化學技術檢測該細胞株表達干細胞表面標志物CD73、CD44、CD90(Thy-1)、CD29(Integrin)、CD105(Endoglin)、CD166(ALCAM)、BMPRⅡ、SSEA4、CD117、CD133。應用BMP9誘導iU
6、SC分化,細胞堿性磷酸酶染色、茜素紅染色、油紅O染色等顯示該細胞向成骨細胞、軟骨細胞及脂肪細胞分化,轉染細胞裸鼠皮下及肌肉接種,4周后無腫瘤形成,通過Micro-CT及病理切片染色等顯示該細胞在BMP9誘導下,在體內(nèi)具有良好的成骨成軟骨及部分成脂多向分化潛能。
結論:運用piggyBac system成功篩選出適合于干細胞基因表達的啟動子hEFH,并用該啟動子通過脂質體轉染技術成功構建SV40Tag永生化尿源性干細胞,生物學鑒
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