脫細胞支架的新法制備及內(nèi)皮前體細胞在瓣膜組織工程中的應(yīng)用.pdf

1、目的：心臟瓣膜疾病是臨床常見病，死亡率高，瓣膜置換是治療心臟瓣膜疾病最有效的方法。然而現(xiàn)有的機械瓣和生物瓣分別存在著需終生抗凝和耐久性差的缺陷，同種瓣膜又存在著來源嚴重不足的限制，因此，都難以滿足臨床的需要。心臟瓣膜組織工程可以克服以上缺陷，構(gòu)建出無免疫源性、可以自我生長修復(fù)的自體活瓣膜替代物，它的研制具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。其中種子細胞來源和支架材料的制備一直是制約組織工程瓣膜實際應(yīng)用的瓶頸問題，這兩個問題的良好解決對組織工程瓣膜的研

2、制具有決定性意義。外周血內(nèi)皮前體細胞在體外可分化為成熟內(nèi)皮，它的獲取過程不會對機體產(chǎn)生創(chuàng)傷；十二烷基肌氨酸鈉是一種氨基酸類表面活性劑，具有低毒、低刺激性的特點。本實驗嘗試以外周血內(nèi)皮前體細胞作為新的種子細胞，以十二烷基肌氨酸鈉作為新型脫細胞試劑制備脫細胞瓣膜支架，探索內(nèi)皮前體細胞種植在脫細胞瓣膜支架上，體外構(gòu)建組織工程瓣膜的可行性并檢測其抗血栓功能。 方法：以密度梯度離心法分離臍血內(nèi)皮前體細胞，用EGM一2-MV培養(yǎng)液將其往成熟

3、內(nèi)皮方向誘導(dǎo)；從細胞形態(tài)和內(nèi)皮細胞特異性標記物的免疫熒光染色兩方面對分化的細胞加以鑒定。用含有O．25％十二烷基肌氨酸鈉消化液以及核酸酶對豬的帶瓣膜管道進行脫細胞處理以制備脫細胞支架材料，并對其進行DNA、可溶性蛋白含量測定，眥、Movat染色和電鏡觀察，細胞體外種植實驗，生物力學(xué)測試，大鼠皮下包埋實驗等多方面檢測。將前體分化的細胞以l×106／cm2的密度種植在脫細胞瓣膜支架上，體外靜態(tài)培養(yǎng)7～10天，構(gòu)建組織工程瓣膜，以MTT檢測觀

4、察其生長情況，以免疫熒光染色和掃描電鏡觀察內(nèi)膜層形成情況，以血小板黏附實驗和RT-PCR檢測eNOS和tPA基因表達綜合評價新生內(nèi)膜的抗血栓功能。 結(jié)果：臍血分離的內(nèi)皮前體細胞經(jīng)誘導(dǎo)后展現(xiàn)出典型的鋪路石樣形態(tài)，吞噬LDL、結(jié)合UEA-1、CD31和vWF染色為陽性，并具有極強的增殖能力。脫細胞帶瓣膜管道中的細胞成分幾乎完全去除，瓣葉和管壁中DNA含量為正常的1．35％和2．8l％，可溶性蛋白含量為正常的8．46％和12．65％；

5、肛和Movat染色顯示組織結(jié)構(gòu)完整、細胞結(jié)構(gòu)完全消失，膠原纖維、彈性纖維、蛋白聚糖等主要基質(zhì)成分充分保留；細胞種植顯示支架細胞相容性良好；瓣膜生物力學(xué)性能與正常無明顯差異；皮下包埋實驗顯示其免疫原性低并具有生物可降解性。MTT檢測表明種植在支架上的內(nèi)皮前體細胞不但存活，而且代謝活躍，具有良好的增殖能力；掃描電鏡顯示組織工程瓣膜表面完全被細胞覆蓋，細胞排列緊密呈鋪路石樣形態(tài)；組織工程瓣膜表面有新生內(nèi)膜層形成，該內(nèi)膜CD3l、vWF染色為陽

6、性，有eNOS和tPA基因的表達，并能有效地防止血小板在瓣膜表面聚集和粘附；而未種細胞的瓣膜支架表面為裸露的膠原纖維，其上有大量聚集呈團塊的血小板黏附。 結(jié)論：十二烷基肌氨酸鈉是一種理想的脫細胞試劑，以此可以建立一套低毒、高效、對組織結(jié)構(gòu)無損傷的脫細胞方法，并制備出生物學(xué)性能優(yōu)異的脫細胞支架材料。外周血內(nèi)皮前體細胞是一種新型的種子細胞來源，它的采集不會造成機體損傷，在體外可以被迅速的誘導(dǎo)分化為成熟內(nèi)皮，可用于構(gòu)建具有抗血栓功能的