超聲微泡介導HGF治療大鼠心肌梗死的實驗研究.pdf

1、冠心病(CHD)是嚴重威脅人類生命和健康的常見疾病。雖然經皮冠脈成形術(PTCA)和冠狀動脈旁路移植術(CABG)挽救了很多患者的生命，但部分嚴重患者的病情并未因此得到明顯改善。近年來基因治療迅速發(fā)展，為冠心病患者提供了一個新的治療策略，但目前由于尚缺乏一種安全、穩(wěn)定、高效的基因轉染方法，而極大地限制了基因治療在臨床上的廣泛應用。新近研究發(fā)現，超聲靶向破壞微泡定位釋放技術(Ultrasound-targeted microbubble

2、destruction，UTMD)是一種新型的無創(chuàng)性基因轉移技術。開展對UTMD介導目的基因靶向治療的深入研究可望為冠心病的基因治療帶來新的治療措施。 本課題是通過構建攜有增強型綠色熒光蛋白(EGFP)和肝細胞生長因子(HGF)基因的真核共表達載體(pIRES2-EGFP/HGF)，制備一種能與pIRES-EGFP/HGF 基因高效結合的超聲微泡造影劑，然后運用超聲靶向破壞微泡(UTMD)介導HGF治療大鼠心肌梗死，觀察治療后E

3、GFP及HGF基因在缺血心肌內的表達情況及治療效果，為研究和評價超聲靶向破壞微泡介導的心臟基因轉染提供可靠的實驗依據，為冠心病基因治療提供一個新的途徑和手段。本課題研究主要包括以下三個部分的內容： 第一部分增強型綠色熒光蛋白與肝細胞生長因子共表達載體的構建及鑒定 目的:構建增強型綠色熒光蛋白與人肝細胞生長因子的基因真核共表達載體并鑒定其在真核細胞中的表達。 方法:在 HGF 兩端設計并合成分別帶有Sac Ⅰ和Ba

4、mH Ⅰ兩酶切位點的一對引物，對pcDNA3.0-HGF載體進行PCR擴增，將擴增出的目的基因與pMD18-T載體相連接，并轉化至大腸肝菌，進行菌落PCR、酶切分析和DNA測序鑒定重組克隆。用Sac Ⅰ和BamHⅠ將目的基因片段用雙酶切切下后，純化提取凝膠中的目的DNA片斷，然后插入plRES2-EGFP相應的酶切位點，構建pIRES2-EGFP/HGF真核表達載體并再進行雙酶切鑒定。將重組質粒用脂質體法轉染至人血管內皮細胞(HUEVC

5、)中，熒光顯微鏡下觀察EGFP在細胞內的表達，Western blot檢測HGF蛋白的表達情況。 結果:重組克隆載體內的目的基因片段序列與GENEBANK上報道的HGF基因序列完全一致，pIRES-EGFP/HGF酶切鑒定結果與預期結果一致。熒光顯微鏡下觀察可見轉染后的細胞發(fā)出綠色熒光；Westernblot結果表明HGF基因得到了有效表達。 結論:本實驗成功構建EGFP和HGF真核共表達載體并可在真核細胞中有效表達。

6、 第二部分載基因脂質超聲造影劑的制備及其特性的實驗研究 目的:制備一種可作為基因載體的脂質超聲造影劑，對其理化性質、兔腎顯影效果及載基因能力進行研究。 方法:采用機械振蕩法制備一種可作為基因載體脂質超聲微泡造影劑，觀察<'60>Co<,γ>射線滅菌前后造影劑外觀、形態(tài)、濃度、平均粒徑和電位改變，并觀察其對正常兔腎顯影效果，檢測其結合基因的能力。 結果:自制脂質微泡的平均粒徑范圍為2.11～6.43μm，平均

7、粒徑2.79μm，粒徑分布均勻，濃度約為(3.16±0.29)×10<'9>個/ml；經<'60>Co<,γ>射線滅菌后在顯微鏡下觀察微泡形態(tài)，粒徑大小及電位等均無明顯變化；體內造影顯示該造影劑能夠有效增強兔腎實質回聲；基因結合量效優(yōu)化結果顯示，造影劑的最大基因結合效率為22％，最大基因結合量為0.45 mg/ml。 結論:自制脂質超聲造影劑符合理想超聲造影劑的要求，性質穩(wěn)定，制備簡易，載基因效率高，可望成為一種新型的超聲微泡造

8、影劑以及基因或藥物治療的載體。 第三部分超聲靶向破壞微泡介導HGF促進大鼠梗死心肌血管新生的實驗 目的:探討超聲靶向破壞微泡介導HGF促進大鼠梗死心肌血管新生的可行性，并評價其治療效果。 方法:將40只 Wistar 大鼠制備成心肌梗死模型后隨機分為4組，即①HGF+超聲+微泡組(HGF+ultrasound+ microbubble，HGF+US/MB)，②HGF+超聲組(HGF+ultrasound grou

9、p， HGF+US)，③HGF+微泡組(HGF+microbubble group，HGF+MB)，④單純手術組(surgery alone group，SA)。①組采用超聲心電觸發(fā)靶向破壞心肌內攜基因微泡，②組采用基因聯(lián)合超聲心電觸發(fā)，而不用微泡，③組只由靜脈輸入載基因微泡，④組由靜脈注入等量生理鹽水作為對照。于基因轉染后14 d處死各組大鼠，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白在各組大鼠心肌、肝及腎組織內的表達情況，免疫組織化學法(IHC)

10、檢測缺血心肌周圍 CD34 的表達，并在顯微鏡下計數心肌內新生微血管密度(MVD)，Western blot和 ELISA 法檢測心肌組織內HGF蛋白表達情況，并對心肌內HGF含量與MVD進行相關性分析。 結果:熒光顯微鏡下可見在HGF+US/MB組大鼠心肌中有大量的綠色熒光蛋白的表達，且心室前壁的表達高于后壁，在HGF+US組中僅于小血管及毛細血管的內皮細胞中有少量綠色熒光蛋白的表達，而SA組及HGF+MB組的心肌內無綠色熒光

11、蛋白的表達；各組大鼠肝及腎組織內均未觀察到EGFP的表達。IHC 結果顯示，CD34定位于血管內皮細胞胞膜和胞漿，顯示為棕黃色或棕褐色顆粒，新生的微血管被染成棕黃色，顯微鏡下計數每高倍鏡視野下的MVD，結果表明在HGF+US/MB組心肌中MVD 最高，為266.9±39.83(個/高倍鏡視野)，與其它各組相比較均有顯著性差異(P<0.01)。Western blot檢測結果顯示：HGF+US/MB組中可見一69 kD大小蛋白條帶表達，H

12、GF+US組可見同等大小的弱蛋白條帶表達，而在HGF+MB組及 SA 組中無明顯蛋白條帶。ELISA 結果顯示HGF在HGF+US/MB組心肌中表達最高，為5.54±0.81 ng/g，目前壁表達高于后壁(P<0.05)，與其它各組心肌 HGF 含量相比較均有顯著性差異(P<0.01)。相關分析表明，心肌中 HGF 的含量與MVD呈明顯正相關。 結論:超聲靶向破壞微泡可介導HGF基因在缺血心肌內的高效轉移并促進血管新生，為心肌梗