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1、泛素C末端水解酶L1(UbiquitinC-terminalhydrolaseL1,UCH-L1)是泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasomesystem,UPS)中一種重要的去泛素化酶(deubiquitinating-enzymes,DUBs),參與并維持大腦中神經(jīng)元的正常結(jié)構(gòu)及認(rèn)知功能。Tau蛋白是神經(jīng)組織中的主要微管相關(guān)蛋白之一,其生理學(xué)功能是促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞骨架與微管的裝配。異常修飾的tau蛋白可以在體內(nèi)逐漸聚
2、集形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)繼而引發(fā)神經(jīng)變性疾病。研究表明,UCH-L1活性與神經(jīng)原纖維纏結(jié)數(shù)量負(fù)相關(guān),提示UCH-L1與tau蛋白的異常病變密切聯(lián)系。因此本研究重點(diǎn)探討UPS系統(tǒng)中UCH-L1功能障礙對(duì)神經(jīng)瘤細(xì)胞(N2acell)中tau蛋白的代謝和功能的影響及其可能機(jī)制。
本實(shí)驗(yàn)用不同濃度(2.5、5、10μM)的UCH-L1活性抑制劑LDN處理N2a細(xì)胞1h,利用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的UPS系統(tǒng)中多聚泛素和單體泛素含量的改變;用
3、免疫印跡和免疫共沉淀的方法分別檢測(cè)細(xì)胞中tau蛋白泛素化、tau蛋白總量和tau蛋白磷酸化以及tau蛋白微管結(jié)合功能的改變;利用Thioflavine-S和AT8染色來(lái)觀察β-折疊結(jié)構(gòu)的異常聚集體的形成以及該聚集體和磷酸化的tau蛋白的共定位關(guān)系;利用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中PSD-95的含量和CREB的活性變化,初步探索了UCH-L1活性抑制與突觸結(jié)構(gòu)和記憶相關(guān)蛋白合成的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)細(xì)胞中多聚泛素含量隨著LDN處理濃度的增
4、大而逐漸增加,而單體泛素的含量則是呈LDN劑量依賴性減少的(P<0.05);(2)細(xì)胞中tau蛋白泛素化水平隨著LDN濃度的增加顯著上升(P<0.05);(3)與對(duì)照組相比,總tau蛋白、tau-Thr205、Thr231、Ser396位點(diǎn)的磷酸化顯色反應(yīng)均呈現(xiàn)出LDN劑量依賴性的增加(P<0.05);(4)通過(guò)紫杉醇穩(wěn)定微管后,在細(xì)胞提取液的上清中檢測(cè)到的tau蛋白(游離的tau蛋白)含量呈LDN劑量依賴性增加(P<0.05),而沉淀
5、中tau蛋白(與微管緊密結(jié)合的tau蛋白)的含量逐漸減少,說(shuō)明隨著UCH-L1活性被抑制,tau蛋白與微管的結(jié)合能力逐漸減弱;(5)分別用AT8抗體(識(shí)別tau-Ser202/Thr205位點(diǎn))和Thioflavine-S染色(識(shí)別異常β-折疊結(jié)構(gòu)的蛋白)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)的免疫熒光共定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著抑制劑LDN濃度的加大,AT8和Thioflavine-S的顯色程度均逐漸加強(qiáng),且兩者在胞內(nèi)具有共定位關(guān)系。這說(shuō)明LDN處理誘導(dǎo)了胞內(nèi)蛋白質(zhì)的
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