抗凋亡蛋白C-FLIP泛素化降解機(jī)制的研究.pdf

1、研究目的:
　　全球癌癥發(fā)病率和死亡人數(shù)迅猛上升，癌癥是目前威脅人類生命健康的主要病因?；瘜W(xué)藥物是治療癌癥的重要手段之一，因此尋找安全高效的化療藥物顯得尤為重要。但現(xiàn)有化療藥物的腫瘤靶向性差，對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞的毒副作用強(qiáng)等特點(diǎn)極大地限制了化學(xué)療法的發(fā)展，因此尋找特異性抗腫瘤的藥物作用靶點(diǎn)是化療發(fā)展的關(guān)鍵，也是科學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)。其中，死亡受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的c-FLIP是很有潛力的腫瘤治療的新靶標(biāo)。
　　腫瘤細(xì)胞過度表達(dá)凋亡抑制

2、蛋白而耐受凋亡是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的標(biāo)志之一。最近的研究表明c-FLIP是一種重要的凋亡抑制蛋白，在許多不同類型的腫瘤細(xì)胞FLIP過度表達(dá)。c-FLIP過度表達(dá)抑制死亡配體如FasL和TRAIL與DISC的結(jié)合而抑制caspase-8的活化，從而阻止腫瘤細(xì)胞凋亡，同時(shí)c-FLIP的下游調(diào)節(jié)能敏化腫瘤細(xì)胞的凋亡。研究表明，眾多小分子抗腫瘤藥物主通過泛素-蛋白酶體途徑降解c-FLIP從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的。泛素蛋白酶體主要通過E3泛素連接酶特異

3、性識(shí)別底物蛋白從而精確地調(diào)控蛋白的降解。因此，鑒定凋亡抑制蛋白c-FLIP的降解過程中起重要作用的E3泛素連接酶，對(duì)于確定新的腫瘤治療靶標(biāo)、了解腫瘤細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制及抗腫瘤藥物的作用機(jī)制都至關(guān)重要。
　　研究方法:
　　1.腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)
　　2.WesternBlot檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)
　　3.免疫共沉淀技術(shù)檢測蛋白相互作用
　　4.RNAi抑制相關(guān)基因的表達(dá)
　　5.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
　　

4、6.熒光顯微鏡共定位
　　研究成果:
　　1利用Cisplatin處理腫瘤細(xì)胞，利用westernblot技術(shù)檢測到BTBD6蛋白升高和c-FLIP蛋白降低。
　　2利用免疫共沉淀技術(shù)檢測BTBD6蛋白與c-FLIP蛋白的相互作用。通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)共定位。
　　3BTBD6蛋白促進(jìn)c-FLIP的降解。通過過表達(dá)BTBD6蛋白可以促進(jìn)c-FLIP蛋白水平的下降。利用siRNA技術(shù)檢測BTBD6在誘

5、導(dǎo)降解中的作用。發(fā)現(xiàn)BTBD6蛋白水平下降，則c-FLIP蛋白降解受到抑制。
　　4通過分段克隆BTBD6和c-FLIP蛋白，檢測其相互作用的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。發(fā)現(xiàn)BTBD6的BTB結(jié)構(gòu)域能夠和c-FLIP的Caspase-like結(jié)構(gòu)域結(jié)合。BTBD6蛋白通過泛素化c-FLIP蛋白促進(jìn)其降解，也能夠同時(shí)促進(jìn)其切割片段的泛素化。
　　5利用免疫共沉淀技術(shù)檢測cullin3蛋白與BTBD6蛋白和c-FLIP蛋白的相互作用。

6、　　結(jié)論:
　　1BTBD6通過泛素化c-FLIP,促進(jìn)其降解，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　2BTBD6通過其BTB結(jié)構(gòu)域與c-FLIP結(jié)合。
　　3BTBD6可以促進(jìn)c-FLIP的降解，也能夠促進(jìn)其切割片段泛素化降解。
　　4BTBD6在細(xì)胞質(zhì)中與c-FLIP共定位，且抑制其泛素化聚集。
　　5Cullin3與BTBD6結(jié)合并促進(jìn)從c-FLIP的降解，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)BTBD