抗凋亡蛋白C-FLIP泛素化降解機制的研究.pdf

1、研究目的:
　　全球癌癥發(fā)病率和死亡人數(shù)迅猛上升，癌癥是目前威脅人類生命健康的主要病因?；瘜W藥物是治療癌癥的重要手段之一，因此尋找安全高效的化療藥物顯得尤為重要。但現(xiàn)有化療藥物的腫瘤靶向性差，對機體正常細胞的毒副作用強等特點極大地限制了化學療法的發(fā)展，因此尋找特異性抗腫瘤的藥物作用靶點是化療發(fā)展的關鍵，也是科學界關注的熱點。其中，死亡受體信號轉導通路中的c-FLIP是很有潛力的腫瘤治療的新靶標。
　　腫瘤細胞過度表達凋亡抑制

2、蛋白而耐受凋亡是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的標志之一。最近的研究表明c-FLIP是一種重要的凋亡抑制蛋白，在許多不同類型的腫瘤細胞FLIP過度表達。c-FLIP過度表達抑制死亡配體如FasL和TRAIL與DISC的結合而抑制caspase-8的活化，從而阻止腫瘤細胞凋亡，同時c-FLIP的下游調(diào)節(jié)能敏化腫瘤細胞的凋亡。研究表明，眾多小分子抗腫瘤藥物主通過泛素-蛋白酶體途徑降解c-FLIP從而促進腫瘤細胞凋亡的。泛素蛋白酶體主要通過E3泛素連接酶特異

3、性識別底物蛋白從而精確地調(diào)控蛋白的降解。因此，鑒定凋亡抑制蛋白c-FLIP的降解過程中起重要作用的E3泛素連接酶，對于確定新的腫瘤治療靶標、了解腫瘤細胞凋亡信號通路的調(diào)控機制及抗腫瘤藥物的作用機制都至關重要。
　　研究方法:
　　1.腫瘤細胞培養(yǎng)
　　2.WesternBlot檢測細胞內(nèi)蛋白的表達
　　3.免疫共沉淀技術檢測蛋白相互作用
　　4.RNAi抑制相關基因的表達
　　5.質(zhì)粒轉染
　　

4、6.熒光顯微鏡共定位
　　研究成果:
　　1利用Cisplatin處理腫瘤細胞，利用westernblot技術檢測到BTBD6蛋白升高和c-FLIP蛋白降低。
　　2利用免疫共沉淀技術檢測BTBD6蛋白與c-FLIP蛋白的相互作用。通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)它們在細胞內(nèi)共定位。
　　3BTBD6蛋白促進c-FLIP的降解。通過過表達BTBD6蛋白可以促進c-FLIP蛋白水平的下降。利用siRNA技術檢測BTBD6在誘

5、導降解中的作用。發(fā)現(xiàn)BTBD6蛋白水平下降，則c-FLIP蛋白降解受到抑制。
　　4通過分段克隆BTBD6和c-FLIP蛋白，檢測其相互作用的蛋白質(zhì)結構域。發(fā)現(xiàn)BTBD6的BTB結構域能夠和c-FLIP的Caspase-like結構域結合。BTBD6蛋白通過泛素化c-FLIP蛋白促進其降解，也能夠同時促進其切割片段的泛素化。
　　5利用免疫共沉淀技術檢測cullin3蛋白與BTBD6蛋白和c-FLIP蛋白的相互作用。

6、　　結論:
　　1BTBD6通過泛素化c-FLIP,促進其降解，從而促進細胞凋亡。
　　2BTBD6通過其BTB結構域與c-FLIP結合。
　　3BTBD6可以促進c-FLIP的降解，也能夠促進其切割片段泛素化降解。
　　4BTBD6在細胞質(zhì)中與c-FLIP共定位，且抑制其泛素化聚集。
　　5Cullin3與BTBD6結合并促進從c-FLIP的降解，從而促進細胞凋亡。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)BTBD