高同型半胱氨酸血癥對(duì)基因組和Bcl-2基因甲基化影響及葉酸的干預(yù)作用.pdf

1、目的：血漿同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）水平升高是動(dòng)脈粥樣硬化（Atheroslerosis，AS）的一項(xiàng)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。由于降低Hcy治療對(duì)于心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的影響還有較大爭(zhēng)議，截止目前，血漿Hcy是否可以作為一個(gè)可調(diào)節(jié)的危險(xiǎn)因素還不清楚。因此進(jìn)一步了解Hcy致AS機(jī)制及藥物降低Hcy同時(shí)對(duì)AS形成的影響成為亟待解決的科學(xué)問題。Hcy和葉酸通過一碳單位代謝途徑將甲基轉(zhuǎn)移給 DNA、組蛋白等大分子物質(zhì)參與其調(diào)控基因表達(dá)功能

2、。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí) DNA甲基化在AS形成和心血管疾病發(fā)生中扮演重要角色。但目前的大多數(shù)研究并沒有探討血漿Hcy水平升高對(duì)DNA甲基化的影響和葉酸是否具有保護(hù)作用。由于在不同組織、不同基因、不同位點(diǎn)的甲基化水平是不同的，所以，通過單個(gè)基因甲基化水平及表達(dá)研究有助于更好地理解 Hhcy的病理生理學(xué)機(jī)制。動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，凋亡參與動(dòng)脈粥樣硬化不同時(shí)期發(fā)生發(fā)展。Hcy可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖，凋亡減弱。導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖的一個(gè)重要原因就

3、是凋亡減弱。Bcl-2是凋亡信號(hào)通路的重要因子，具有抗凋亡作用，參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)過氧化和炎癥刺激后血管的凋亡過程，可以作為治療 AS的關(guān)鍵靶點(diǎn)。但目前有關(guān) Hhcy對(duì) Bcl-2基因甲基化水平的影響和葉酸是否具有拮抗作用的研究未見報(bào)道。本研究從DNA甲基化角度探討Hcy在AS形成中的作用和葉酸的拮抗作用，為進(jìn)一步治療AS這一全球醫(yī)學(xué)難題提供理論依據(jù)。
　　方法：健康6周齡雄性wistar大鼠36只，體重(160±10)g，適應(yīng)性喂養(yǎng)一

4、周后隨機(jī)分為對(duì)照組，高同型半胱氨酸組，和葉酸干預(yù)組，每組12只。對(duì)照組給予AIN-93G配方飼料，高同型半胱氨酸組飼以含1.7％蛋氨酸的AIN-93G配方飼料，葉酸干預(yù)組飼以含1.7％蛋氨酸和0.008％葉酸的AIN-93G配方飼料。喂養(yǎng)18周后，全自動(dòng)生化儀測(cè)定血漿Hcy、葉酸濃度；取大鼠胸主動(dòng)脈進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)變化；免疫組化檢測(cè)的主動(dòng)脈組織Bcl-2基因表達(dá)，改進(jìn)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(MDQ1)檢測(cè)大

5、鼠主動(dòng)脈組織DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活力和基因組總甲基化水平。結(jié)合重亞硫酸鹽限制性內(nèi)切酶法（combined bisulfite restriction analysis，COBRA）法檢測(cè)LINE-1序列甲基化水平；巢式降落式PCR聯(lián)合甲基化特異性PCR（MSP）檢測(cè)主動(dòng)脈組織Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平；熒光RT-PCR檢測(cè)主動(dòng)脈組織Bcl-2 mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果：18周蛋氨酸飲食可以誘導(dǎo)大鼠高同型半胱氨酸血癥，葉酸攝入可以

6、拮抗血漿同型半胱氨酸(Hcy)升高(P<0.01)及其介導(dǎo)的主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化；高同型半胱氨酸組主動(dòng)脈組織DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活力和基因組總甲基化水平明顯低于對(duì)照組(P<0.01, P<0.01)；高同型半胱氨酸組主動(dòng)脈組織LINE-1序列甲基化水平低于對(duì)照組(P<0.05)；高同型半胱氨酸組主動(dòng)脈組織Bcl-2表達(dá)增加；Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平低于對(duì)照組（P<0.05）， Bcl-2基因mRNA表達(dá)高于對(duì)照組（P<0.05）。葉酸干

7、預(yù)后，主動(dòng)脈組織DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活力和基因組總甲基化水平明顯升高(P<0.01,P<0.05)，主動(dòng)脈組織 LINE-1序列甲基化水平升高(P<0.05)。主動(dòng)脈組織Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)目減少，Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平高于高同型半胱氨酸組（P<0.05），Bcl-2 mRNA表達(dá)低于高同型半胱氨酸組（P<0.05）。
　　結(jié)論：葉酸攝入不僅可以拮抗血漿Hcy水平升高，而且升高主動(dòng)脈組織DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活力和基因組總甲基化水