內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和組蛋白甲基化在高同型半胱氨酸血癥促斑塊不穩(wěn)定中作用和機制研究.pdf

1、目的：
　　動脈粥樣硬化是起源于脂代謝失衡和炎癥過度激活的慢性血管壁疾病。數(shù)十年來，動脈粥樣硬化相關(guān)疾病已成為全球致殘、致死的首要原因。在我國，隨著人民生活水平提高和飲食習(xí)慣的改變，動脈粥樣硬化及其相關(guān)疾病的發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年升高的趨勢，成為主要的死亡原因。臨床研究表明引起急性心血管事件的主要原因是冠狀動脈晚期粥樣硬化斑塊的突然破裂以及由此引發(fā)的血栓形成，而動脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定是導(dǎo)致斑塊破裂的重要原因。因此，研究影響斑塊易損性的

2、因素和機制，探索相應(yīng)的干預(yù)方法，對冠心病的防治具有重要的價值。數(shù)百項臨床觀察性研究提示同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）與動脈粥樣硬化密切相關(guān)。尤為重要的是，臨床中已證實高同型半胱氨酸血癥是頸動脈和冠狀動脈易損斑塊形成的獨立危險因素。在動脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠模型發(fā)現(xiàn)存在高同型半胱氨酸血癥促進斑塊不穩(wěn)定。觀察發(fā)現(xiàn)病變區(qū)富含巨噬細(xì)胞凋亡和增大的壞死核心形成是斑塊進展的重要組織學(xué)特征。巨噬細(xì)胞凋亡貫穿動脈粥樣硬化形成始終

3、。與早期動脈粥樣硬化形成不同，多個研究證實病變區(qū)巨噬細(xì)胞凋亡與不穩(wěn)定斑塊形成密切相關(guān)。但是高同型半胱氨酸血癥如何調(diào)控巨噬細(xì)胞凋亡和不穩(wěn)定斑塊形成機制不清。慢性持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活未折疊蛋白反應(yīng)促進巨噬細(xì)胞凋亡。但高同型半胱氨酸血癥是否通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進巨噬細(xì)胞凋亡和不穩(wěn)定斑塊形成，目前未見報道；另一方面，動脈粥樣硬化發(fā)病機制極其復(fù)雜，是環(huán)境和遺傳因素長期共同作用的結(jié)果。最強的遺傳因素也僅能解釋大約10%的心血管發(fā)病機制。同型半胱氨酸

4、（Homocysteine，Hcy）是體內(nèi)轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)的重要中間代謝產(chǎn)物，通過向DNA或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運甲基調(diào)控基因表達(dá)。體內(nèi)和體外實驗已證實Hcy對基因組和候選基因甲基化的調(diào)控作用。所以，通過表觀調(diào)控探索Hcy促動脈粥樣硬化發(fā)病機制至關(guān)重要。近期，越來越多的證據(jù)顯示組蛋白甲基化在斑塊不穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。但是，組蛋白調(diào)控在Hcy促進不穩(wěn)定斑塊中的作用目前仍不清楚。
　　所以，本研究中擬通過體內(nèi)和體外實驗，探討：
　?、倬奘杉?xì)胞凋亡

5、在Hcy促進不穩(wěn)定斑塊形成中的作用。
　　②內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在Hcy促進巨噬細(xì)胞凋亡和不穩(wěn)定斑塊形成中的機制。
　?、劢M蛋白甲基化在Hcy促進巨噬細(xì)胞凋亡和不穩(wěn)定斑塊形成中的作用。為臨床預(yù)防和干預(yù)動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊形成提供新的靶點。
　　方法：
　　第一部分：
　　8周齡雄性C57BL/6J小鼠和ApoE-/-小鼠各36只，隨機分為對照組（12只），高蛋氨酸飼養(yǎng)組（12只）和葉酸干預(yù)組（12只），對照組飼以普

6、通AIN-93G飼料，高蛋氨酸飼養(yǎng)組飼以含1.7%蛋氨酸的AIN-93G飼料，葉酸干預(yù)組飼以含1.7%的蛋氨酸加0.0008%葉酸AIN-93G飼料，連續(xù)飼喂養(yǎng)20周。干預(yù)期滿后，眼球取血，處死小鼠，全自動生化儀檢測血清Hcy和血脂水平。主動脈大體染色和主動脈竇染色評估斑塊面積和壞死核心面積，多種特殊染色評估斑塊穩(wěn)定性。TUNEL染色評估斑塊區(qū)凋亡細(xì)胞。培養(yǎng)Raw264.7巨噬細(xì)胞，在ox-LDL基礎(chǔ)上給予Hcy干預(yù)，AVPI和TUNE

7、L技術(shù)評估巨噬細(xì)胞凋亡，油紅O染色觀察巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積，Western Blot檢測線粒體凋亡通路凋亡基因的表達(dá)；
　　第二部分：
　　8周齡雄性ApoE-/-小鼠36只，分為對照組（12只），高蛋氨酸飼養(yǎng)組（12只）和4-PBA干預(yù)組（12只），對照組飼以普通AIN-93G飼料，高蛋氨酸飼養(yǎng)組飼以含1.7%蛋氨酸的AIN-93G飼料，4-PBA干預(yù)組飼以含1.7%蛋氨酸的AIN-93G飼料12周后，腹腔注射4-PBA8周。

8、三組小鼠總共干預(yù)20周后，眼球取血，處死小鼠，全自動生化儀檢測血清Hcy和血脂水平。主動脈大體染色和主動脈竇染色評估斑塊面積和壞死核心面積，多種特殊染色評估斑塊穩(wěn)定性。TUNEL染色評估斑塊凋亡細(xì)胞。培養(yǎng)Raw264.7巨噬細(xì)胞，在ox-LDL基礎(chǔ)上給予Hcy和4-PBA干預(yù)，AVPI和TUNEL技術(shù)評估巨噬細(xì)胞凋亡，油紅O染色觀察巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積，Western Blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子和線粒體凋亡通路凋亡基因的表達(dá)；
　　第

9、三部分：
　　使用第一部分實驗的ApoE-/-小鼠主動脈標(biāo)本，免疫組化和Western Blot檢測主動脈H3K4m2和H3K9m2的表達(dá)。培養(yǎng)Raw264.7巨噬細(xì)胞，在ox-LDL基礎(chǔ)上給予Hcy、組蛋白抑制劑BIX01294和葉酸干預(yù)，AVPI和TUNEL檢測巨噬細(xì)胞凋亡，油紅O染色觀察巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積，Western Blot檢測組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a和SUV39H1的表達(dá)和線粒體凋亡途徑基因的表達(dá)。
　　結(jié)果我們觀

10、察到：
　　第一部分
　?。?）20周高蛋氨酸飲食成功誘導(dǎo)了Hhcy，但對血脂無明顯影響；
　?。?）單純高蛋氨酸飲食不能誘發(fā)C57BL/6J小鼠發(fā)生動脈粥樣硬化斑塊；
　?。?）高蛋氨酸飲食誘導(dǎo)的Hhcy ApoE-/-小鼠主動脈斑塊面積和壞死核心面積增大；
　?。?）高蛋氨酸飲食誘導(dǎo)的Hhcy促進ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定；
　?。?）高蛋氨酸飲食誘導(dǎo)的Hhcy促進ApoE-/-小鼠

11、斑塊區(qū)細(xì)胞凋亡；
　?。?）Hcy促進Raw264.7巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積和泡沫化；
　　（7）Hcy促進Raw264.7巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡；
　?。?）Hcy促進Raw264.7巨噬細(xì)胞Cleaved caspase3，Bax表達(dá)，抑制Bcl-2表達(dá)；
　　第二部分：
　?。?）4-PBA改善Hhcy誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠主動脈斑塊進展和壞死核心增大，抑制斑塊不穩(wěn)定；
　?。?0）4-PBA減緩高蛋氨酸

12、飲食誘導(dǎo)的 ApoE-/-小鼠主動脈斑塊細(xì)胞凋亡；
　?。?1）4-PBA抑制 Hcy誘導(dǎo)的Raw264.7巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積和凋亡；
　?。?2）高蛋氨酸飲食誘導(dǎo)的Hhcy促進小鼠主動脈組織ERS因子表達(dá)升高。4-PBA具有拮抗作用；
　?。?3）Hcy促進Raw264.7巨噬細(xì)胞ERS因子表達(dá)升高。4-PBA具有拮抗作用；
　?。?4）4-PBA能夠改善Hcy誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞Bcl-2途徑凋亡因子變化；
　

13、?。?5）高蛋氨酸飲食誘導(dǎo)的Hhcy抑制ApoE-/-小鼠主動脈斑塊H3K9m2表達(dá)，但對H3K4m2表達(dá)無明顯影響；
　　（16）Hcy調(diào)控Raw264.7巨噬細(xì)胞組蛋白H3K9m2和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a表達(dá)；
　　（17）組蛋白H3K9m2參與調(diào)控Hcy誘導(dǎo)的體外巨噬細(xì)胞泡沫化；
　　（18）組蛋白H3K9m2調(diào)控Hcy誘導(dǎo)的Raw264.7巨噬細(xì)胞凋亡；
　　（19）組蛋白H3K9m2調(diào)控線粒體凋亡通路基