抑癌基因PTEN在肝癌組織中的表達(dá)及HCV核心蛋白對PTEN作用的研究.pdf

1、PTEN是第一個(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基因，是一種廣泛的多腫瘤抑制基因, 其適度的表達(dá)可阻止細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管生成。多數(shù)學(xué)者認(rèn)同PTEN是一個(gè)可與p53、pRb相提并論的重要功能分子，成為又一個(gè)抑癌明星基因。PTEN可能通過多種機(jī)制導(dǎo)致其功能性失活，包括遺傳（如基因的突變、缺失）和表遺傳方面（如DNA啟動(dòng)子區(qū)的甲基化、染色質(zhì)組蛋白的化學(xué)修飾）的影響，以及轉(zhuǎn)錄、翻譯后的調(diào)控等。在HCC組織中PTEN的

2、表達(dá)缺失可以導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生惡變，失去了對細(xì)胞生長的負(fù)調(diào)控，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)行性生長。盡管有文獻(xiàn)報(bào)道PTEN蛋白在HCC中表達(dá)率較低，但其低表達(dá)的機(jī)制不甚明了。 為了探討抑癌基因PTEN在HCC中的表達(dá)失活的原因，我們首先對56例原發(fā)性肝癌標(biāo)本進(jìn)行了PTEN免疫組化研究，結(jié)果顯示PTEN蛋白在肝癌組織中的陽性表達(dá)率明顯低于癌旁肝組織(P＜0.01），且其表達(dá)程度與HCC的病理分級(jí)明顯相關(guān)；同時(shí)，在腫瘤TNM分期中，Ⅱ期的PTEN陽性率

3、顯著高于Ⅲ、Ⅳ期，而發(fā)生肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的肝癌組織PTEN陽性率低于未轉(zhuǎn)移的肝癌組織。提示PTEN可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移進(jìn)程中起重要作用。 為了尋找PTEN在HCC組織中低表達(dá)的原因，本研究采用了PCR-SSCP技術(shù)結(jié)合DNA測序，尋找PTEN編碼區(qū)基因的突變；結(jié)合PTEN在其它腫瘤突變的特點(diǎn)，選擇了PTEN突變的熱點(diǎn)區(qū)－第5、8號(hào)外顯子進(jìn)行檢測。盡管PCR-SSCP檢測和測序證實(shí)5例標(biāo)本發(fā)生了PTEN基因突變，但突變均位于內(nèi)含子

4、4區(qū)域，而在5號(hào)外顯子和8號(hào)外顯子編碼區(qū)域沒有檢測到PTEN突變的發(fā)生，且在這5例突變的標(biāo)本中，三例PTEN免疫組化呈陰性表達(dá)，兩例呈陽性表達(dá)。因此，在HCC組織中基因突變可能不是PTEN失活的主要原因。我們采用甲基化特異的PCR法（MSP）進(jìn)一步從目前對PTEN缺失機(jī)制研究較熱的DNA啟動(dòng)子甲基化角度尋找原因，結(jié)果在56例HCC組織中，9例標(biāo)本發(fā)生PTEN啟動(dòng)子區(qū)的甲基化（16.1％），且這9例標(biāo)本PTEN免疫組化均呈陰性表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)

5、分析表明：啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化在HCC組織病理分級(jí)中有顯著差別。這一結(jié)果表明，PTEN啟動(dòng)子甲基化可能是HCC組織中PTEN低表達(dá)的原因之一，基因啟動(dòng)子甲基化在PTEN失活導(dǎo)致的HCC的發(fā)生、發(fā)展中可能起重要作用。 丙型肝炎病毒（HCV）是與肝細(xì)胞肝癌發(fā)生密切相關(guān)的致病因子。HCV通過其表達(dá)的蛋白質(zhì)參與癌變。其中以核心蛋白、NS3和NS5蛋白與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化關(guān)系最為密切。HCV核心蛋白具有致癌潛能，目前認(rèn)為，核心蛋白可能通過作用于

6、宿主細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白，激發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)而發(fā)揮致癌效應(yīng)。盡管對PTEN作用機(jī)制目前研究較多，但對PTEN表達(dá)的調(diào)控所知甚少，直到近兩年來，對PTEN基因和蛋白的調(diào)控研究才有所進(jìn)展。而在肝癌組織中研究PTEN表達(dá)的調(diào)控更為罕見。為此，在本實(shí)驗(yàn)中，我們選擇了HCC的重要致癌因素－HCV的核心蛋白為研究對象，探討核心蛋白在可能的致癌途徑中對抑癌基因PTEN發(fā)揮了什么樣的作用。本研究選擇肝癌細(xì)胞系HepG2為實(shí)驗(yàn)對象，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了HCV核心蛋白，并觀

7、察到轉(zhuǎn)染核心蛋白組細(xì)胞的生長較HepG2細(xì)胞組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組細(xì)胞生長快，克隆形成率也較后兩組高；而經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測三組細(xì)胞的細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染核心蛋白組S期的細(xì)胞比例略高于空質(zhì)粒組和HepG2細(xì)胞組。這一結(jié)果驗(yàn)證了HCV核心蛋白能夠引起細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞生長。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)HCV核心蛋白促進(jìn)細(xì)胞生長的作用與其對抑癌基因PTEN的抑制作用有關(guān)。本研究又從基因mRNA和蛋白水平兩方面進(jìn)行了驗(yàn)證。采用Real-time RT-PCR的方法對PT

8、EN基因mRNA的水平進(jìn)行實(shí)時(shí)半定量的檢測，發(fā)現(xiàn)其與HepG2細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染核心蛋白組PTEN基因mRNA的水平明顯下調(diào)。轉(zhuǎn)染不同濃度的核心蛋白編碼基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞隨著轉(zhuǎn)染核心蛋白編碼基因濃度的增大，PTEN mRNA的水平逐漸降低。表明，HCV核心蛋白可以下調(diào)抑癌基因PTEN mRNA的水平，且這種抑制作用隨著核心蛋白濃度的增大而增強(qiáng)。在蛋白質(zhì)水平，通過對PTEN蛋白和其下游分子AKT、p－AKT進(jìn)行Western

9、blot檢測，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染核心蛋白組PTEN蛋白的表達(dá)水平低，而p－AKT的表達(dá)水平高，提示HCV核心蛋白抑制了PTEN基因蛋白的表達(dá)，進(jìn)而解除了PTEN抑制其下游作用分子AKT磷酸化的作用，使PTEN對PI3K/AKT通路的負(fù)調(diào)控作用減弱，不能完全行使其抑制細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。這也進(jìn)一步揭示了HCV核心蛋白能夠促進(jìn)細(xì)胞生長、抑制宿主細(xì)胞凋亡、促進(jìn)肝細(xì)胞腫瘤發(fā)生的原因。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染HCV核心蛋白的HepG2細(xì)胞NF-

10、κB被活化，而在NF-κB的抑制劑PDTC作用下，NF-κB的活性降低，失去了對PTEN表達(dá)的抑制作用，使PTEN部分恢復(fù)負(fù)調(diào)控AKT磷酸化的功能。雙熒光素酶檢測后發(fā)現(xiàn)，，被激活的NF-κB可通過作用于PTEN啟動(dòng)子區(qū)來調(diào)節(jié)PTEN的表達(dá)，使PTEN表達(dá)下降。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PTEN蛋白在肝癌組織中的陽性表達(dá)率低于癌旁肝組織，提示PTEN可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移進(jìn)程中起重要作用。經(jīng)基因突變和甲基化檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)在HCC組織中

11、基因突變可能不是PTEN失活的主要原因，而PTEN啟動(dòng)子甲基化可能是在HCC組織中PTEN低表達(dá)的原因之一，而基因啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致PTEN失活，可能在HCC的發(fā)生、發(fā)展中起一定作用。在肝癌HepG2細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染HCV核心蛋白，細(xì)胞生長速度加快，增殖能力提高，同時(shí)抑癌基因PTEN mRNA和蛋白的表達(dá)水平均受到抑制作用，進(jìn)而解除了PTEN抑制其下游作用分子AKT磷酸化的作用；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HCV核心蛋白可能通過激活NF-κB分子，使活化