抑癌基因pten在原始卵泡啟動(dòng)生長(zhǎng)中的作用及機(jī)制.pdf

1、目的：
　　 本課題擬通過(guò)原始卵泡體外培養(yǎng)模型，探究調(diào)控原始卵泡啟動(dòng)生長(zhǎng)的重要基因pten在原始卵泡的表達(dá)；利用攜帶pten-shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染離體卵巢，觀察pten下調(diào)對(duì)原始卵泡啟動(dòng)生長(zhǎng)的影響，進(jìn)而探討pten在原始卵泡啟動(dòng)生長(zhǎng)中的作用及機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.無(wú)菌條件下獲取2日齡SD雌性大鼠卵巢，分別在Waymouth培養(yǎng)體系中培養(yǎng)0、4、8天。采用HE染色法觀察0，4，8天卵巢中原始卵泡的表達(dá)

2、和數(shù)量變化；采用PCR法觀察pten mRNA在原始卵泡的表達(dá)；采用免疫組化法觀察0，4，8天卵巢中PTEN蛋白在原始卵泡的定位和表達(dá)。
　　 2.有效干擾片段的篩選，pten-shRNA慢病毒的包裝，選擇最佳感染時(shí)間和最佳感染復(fù)數(shù)(MOI：感染時(shí)病毒和細(xì)胞數(shù)量的比值)，應(yīng)用RT-PCR和western blot法驗(yàn)證pten-shRNA慢病毒基因沉默效率。應(yīng)用熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)變化，并放射免疫檢測(cè)0，4，8天培養(yǎng)液中激素

3、含量的變化。
　　 3.應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002，慢病毒轉(zhuǎn)染最佳干擾片段pten-shRNA。應(yīng)用HE染色法觀察各處理組原始卵泡啟動(dòng)生長(zhǎng)發(fā)育，用RT-PCR法觀察ptenmRNA的表達(dá)含量的變化，用western blot觀察PTEN蛋白的表達(dá)變化及信號(hào)通路PI3K蛋白的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.原始卵泡數(shù)在卵泡總數(shù)中的比例隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而減少；pten mRNA在原始卵泡中有表達(dá)，隨著卵

4、泡的發(fā)育表達(dá)強(qiáng)度逐漸減少；PTEN蛋白在0，4，8天組原始卵泡中均有表達(dá)，表達(dá)部位由卵母細(xì)胞胞漿轉(zhuǎn)向顆粒細(xì)胞胞漿，隨著卵泡的發(fā)育表達(dá)量逐漸減少。
　　 2.Pten-shRNA慢病毒感染后，最佳感染時(shí)間為卵巢取出后的36h，最佳感染復(fù)數(shù)MOI=1.0×109×20×10-3/1×106=20.用HE染色，RT-PCR和western blot法檢測(cè)，與對(duì)照組相比，原始卵泡數(shù)占卵泡總數(shù)的比例降低，pten mRNA和PTEN蛋白表

5、達(dá)量明顯下降。Pten-shRNA慢病毒感染后的培養(yǎng)液中雌激素含量降低，孕激素顯著降低。
　　 3.加入PI3K抑制劑LY294002后，與空白組相比，pten mRNA表達(dá)變化不明顯，原始卵泡數(shù)占所有卵泡總數(shù)的比例升高，原始卵泡發(fā)育受抑制。Pten-shRNA慢病毒感染后，用western blot觀察PTEN蛋白表達(dá)在8天正常組比0天正常組下降，8天最佳干擾組比8天正常組下降。PI3K蛋白表達(dá)在8天最佳干擾組比8天正常組下降