脈沖磁場和補(bǔ)陽還五湯對(duì)腦缺血再灌注大鼠IGF-1表達(dá)影響的研究.pdf

1、研究背景： 近年來，對(duì)磁場的生物學(xué)效應(yīng)及治療作用進(jìn)行了深入的研究，磁場對(duì)腦損傷性疾病的影響研究已成為一個(gè)熱點(diǎn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究均證實(shí)磁刺激對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，有助于改善急性腦梗死患者神經(jīng)功能缺損。本課題設(shè)計(jì)利用磁場干預(yù)大鼠腦缺血再灌注模型，探討磁場對(duì)腦缺血大鼠腦內(nèi)IGF-1表達(dá)的影響以及對(duì)神經(jīng)功能缺失、腦缺血梗死面積、缺血后病理組織學(xué)的影響，為磁場的神經(jīng)保護(hù)作用提供實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。 補(bǔ)陽還五湯(BYHWD)始載

2、于《醫(yī)林改錯(cuò)》，由清代名醫(yī)王清任所創(chuàng)，以補(bǔ)氣藥與活血祛瘀藥相配伍，以益氣固攝為主，化瘀通絡(luò)為輔，具有補(bǔ)氣活血，通經(jīng)活絡(luò)的功效，是治療氣虛血瘀型腦缺血疾病的名方。本文利用BYHWD灌注腦缺血再灌注大鼠，觀察BYHWD對(duì)IGF-1表達(dá)的影響以及BYHWD對(duì)神經(jīng)功能缺失、腦缺血梗死面積、缺血后病理組織學(xué)的影響，以期發(fā)現(xiàn)BYHWD與IGF-1在神經(jīng)修復(fù)方面有無內(nèi)在關(guān)系，為BYHWD的神經(jīng)保護(hù)作用提供新的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。 目的：觀察腦缺血再灌

3、注后時(shí)間與IGF-1表達(dá)的關(guān)系，研究磁場、BYHWD對(duì)腦缺血再灌注大鼠IGF-1表達(dá)的影響，為磁場、BYHWD的腦保護(hù)作用提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。 設(shè)計(jì)：完全隨機(jī)設(shè)計(jì)。 方法： 1.40只SpragueDawley(SD)大鼠分為假手術(shù)組、缺血再灌注后2h組、1d組、3d組和7d組，每組8只。2h組、1d組、3d組、7d組用線栓法阻斷右側(cè)大腦中動(dòng)脈供血，2h后撥出線栓恢復(fù)大腦中動(dòng)脈供血制成右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模

4、型，假手術(shù)組僅做右側(cè)頸外動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈結(jié)扎，不做右側(cè)大腦中動(dòng)脈線栓栓塞。參照ZealLonga5分法進(jìn)行評(píng)分。0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：輕度局灶性神經(jīng)功能缺損，即提尾懸空不能伸展左側(cè)前爪；2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺損，即行走向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：中度局灶性神經(jīng)功能缺損，即行走困難，并向左側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)水平下降。評(píng)分1～4分為造模成功。32只大鼠造模成功。各組動(dòng)物分別在造模后0h(假手術(shù)組)、2h、1d、3d、7d處死

5、，斷頭取腦。主要觀察指標(biāo)：用免疫組化法(IHC)觀察各組梗死區(qū)IGF-1的表達(dá)。 2.80只SD大鼠分為假手術(shù)組、模型組、脈沖磁場組、BYHWD組、脈沖磁場聯(lián)合BYHWD組(聯(lián)合組)，每組16只，模型組、脈沖磁場組、BYHWD組和聯(lián)合組制作右側(cè)MCAO模型，假手術(shù)組僅做右側(cè)頸外動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈結(jié)扎，不做右側(cè)大腦中動(dòng)脈線栓栓塞。脈沖磁場組和聯(lián)合組于造模結(jié)束后開始用脈沖磁療儀進(jìn)行干預(yù)，異名磁極對(duì)置于大鼠頭部，磁距為7～10cm，磁場強(qiáng)

6、度為0～0.01T，頻率為50HZ，20min／次，每天1次，連續(xù)7d；BYHWD組和聯(lián)合組予灌服BYHWD水煎液，按生藥13.3g／kg灌胃，連續(xù)給藥7d；假手術(shù)組和模型組不作磁場處理及BYHWD灌胃處理。7d后處死各組大鼠，斷頭取腦。主要觀察指標(biāo)：①分別在2h、1d、3d、7d進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評(píng)分；②采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色觀察梗死面積大??；③蘇木素-伊紅染色(HE)觀察病理組織學(xué)改變；④IHC檢測IGF-1的

7、表達(dá)。 結(jié)果：120只大鼠進(jìn)入結(jié)果分析。 1.腦缺血再灌注大鼠IGF-1的表達(dá) 采用單因素方差分析的檢驗(yàn)方法，組間多重比較采用LSD檢驗(yàn)，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=60.867，P=0.000)。經(jīng)組間多重比較顯示：IGF-1在假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)最弱，與假手術(shù)組相比，缺血再灌注后2h組、1d組、3d組、7d組梗死區(qū)陽性細(xì)胞數(shù)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；與2h組、1d組相比，3d組陽性細(xì)胞數(shù)增多，

8、其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；與3d組相比，7d組陽性細(xì)胞數(shù)有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；與1d組相比，7d組陽性細(xì)胞數(shù)無顯著性差異(P=0.712)，但與假手術(shù)組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。 2.脈沖磁場、BYHWD對(duì)腦缺血再灌注大鼠IGF-1表達(dá)的影響 2.12h、1d、3d、7d神經(jīng)功能缺失評(píng)分 采用重復(fù)測量的檢驗(yàn)方法，時(shí)間因素不同水平組間多重比較及固定時(shí)間因素后不同實(shí)

9、驗(yàn)分組間的多重比較均采用LSD方法。 假手術(shù)組在2h、1d、3d、7d時(shí)神經(jīng)功能缺失評(píng)分均為0分。模型組、脈沖磁場組、BYHWD組和聯(lián)合組各組間比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=5.479，P=0.032)，神經(jīng)功能缺失評(píng)分在不同的時(shí)間之間有顯著差異(F=106.922，P=0.000)，組別與時(shí)間有交互效應(yīng)(F=3.867，P=0.000)。從3d開始，各組神經(jīng)功能缺失評(píng)分隨時(shí)間的延長呈逐漸下降趨勢：從時(shí)間點(diǎn)來看，2h和1d時(shí)模型組、脈

10、沖磁場組、BYHWD組和聯(lián)合組的評(píng)分無顯著差異(F=0.760，P=0.521和F=1.538，P=0.214)；3d時(shí)模型組、脈沖磁場組、BYHWD組和聯(lián)合組的評(píng)分有顯著差異(F=12.612，P=0.000)，BYHWD組、脈沖磁場組和聯(lián)合組的評(píng)分低于模型組，聯(lián)合組的評(píng)分低于BYHWD組、脈沖磁場組；7d時(shí)模型組、脈沖磁場組、BYHWD組和聯(lián)合組的評(píng)分有顯著差異(F=4.609，P=0.002)，脈沖磁場組、BYHWD組和聯(lián)合組評(píng)分

11、均低于模型組，脈沖磁場組、BYHWD組和聯(lián)合組評(píng)分無顯著性差異 2.2腦組織TTC染色結(jié)果 腦梗死面積百分?jǐn)?shù)的比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD檢驗(yàn)。假手術(shù)組腦組織切片均紅染，無白色梗死灶。模型組大鼠梗死灶位于缺血側(cè)腦組織額頂部外側(cè)皮層，腦梗死灶明顯，梗死區(qū)內(nèi)壞死組織呈蒼白色，未壞死組織呈玫瑰紅色。各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=30.383，P=0.000)。經(jīng)組間多重比較顯示：與模型組相比，脈沖磁場組、B

12、YHWD組、聯(lián)合組梗死面積均減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。與脈沖磁場組相比，BYHWD組梗死面積差異沒有顯著性意義(P=0.552)。聯(lián)合組與脈沖磁場組和BYHWD組相比，梗死面積減小，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009，P=0.035)。 2.3腦組織切片HE染色結(jié)果 假手術(shù)組：神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目多，形態(tài)結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞排列規(guī)整。核深染，核膜清晰，核仁明顯。高倍鏡下可見神經(jīng)元細(xì)胞胞漿豐富，呈灰藍(lán)色斑塊狀，表明尼氏體

13、豐富。 模型組：壞死區(qū)結(jié)構(gòu)紊亂，組織染色變淺，組織結(jié)構(gòu)疏松，膠質(zhì)細(xì)胞增生，部分神經(jīng)元細(xì)胞核固縮，胞體縮小變形，殘留的神經(jīng)元細(xì)胞周圍間隙增寬，神經(jīng)元細(xì)胞正常形態(tài)消失，胞質(zhì)紅染、均勻，可見鬼影細(xì)胞。邊緣區(qū)低倍鏡下可見較多形態(tài)大致正常的神經(jīng)元細(xì)胞，膠質(zhì)細(xì)胞無明顯增生，組織顏色較深。在高倍鏡下可見邊緣區(qū)部分神經(jīng)元細(xì)胞漿染色呈淡染，尼氏小體消失，并可見神經(jīng)元細(xì)胞核固縮。 脈沖磁場組：壞死區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞較模型組增生明顯，形成膠質(zhì)結(jié)節(jié)，出

14、現(xiàn)噬神經(jīng)現(xiàn)象，仍可見較完整的紅色神經(jīng)元細(xì)胞，個(gè)別神經(jīng)元細(xì)胞核固縮，胞體縮小變形。邊緣區(qū)在高倍鏡下可見邊緣區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞胞漿藍(lán)染，呈顆粒狀，尼氏體豐富。神經(jīng)元形態(tài)較規(guī)整，核深染，核仁清。 BYHWD組：壞死區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞較模型組增生明顯，有膠質(zhì)結(jié)節(jié)形成，可見較完整的紅色神經(jīng)元細(xì)胞，個(gè)別神經(jīng)元細(xì)胞核固縮，胞體縮小變形。高倍鏡下可見邊緣區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞胞漿藍(lán)染，顆粒狀，尼氏體較豐富，神經(jīng)元形態(tài)較規(guī)整，核深染，核仁清。 聯(lián)合組：壞死區(qū)膠質(zhì)

15、細(xì)胞較模型組增生明顯，可見完整的紅色神經(jīng)元細(xì)胞。高倍鏡下可見邊緣區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)規(guī)整，核深染，核仁清，神經(jīng)元細(xì)胞胞漿藍(lán)染明顯，呈顆粒狀，尼氏體豐富。 2.4脈沖磁場和BYHWD干預(yù)后IGF-1的表達(dá)結(jié)果 脈沖磁場與BYHWD干預(yù)后IGF-1陽性細(xì)胞數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD檢驗(yàn)。各組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=592.714，P=0.000)。經(jīng)組間多重比較顯示，IGF-1陽性細(xì)胞數(shù)在假手術(shù)組最少

16、；與假手術(shù)組相比，模型組缺血再灌注7d后缺血梗死側(cè)大腦皮層IGF-1陽性細(xì)胞數(shù)增多，差異有顯著性意義(P=0.007)；與假手術(shù)組和模型組相比，BYHWD組缺血再灌注7d后IGF-1陽性細(xì)胞數(shù)增多，差異有顯著性意義(P=0.000)；與假手術(shù)組、模型組和BYHWD組相比，脈沖磁場組陽性細(xì)胞數(shù)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與假手術(shù)組、模型組、脈沖磁場組和BYHWD組相比，聯(lián)合組再灌注7d后IGF-1陽性細(xì)胞數(shù)增多，差異有顯著性意義(P=0.00

17、0)。 結(jié)論：正常情況下腦組織中僅有少量IGF-1表達(dá)，腦缺血再灌注發(fā)生后，腦中IGF-1的自分泌即啟動(dòng)，再灌注3d后IGF-1的表達(dá)達(dá)到高峰，7d缺血側(cè)大腦皮層IGF-1的表達(dá)有所下降，但仍明顯高于假手術(shù)組。這表明腦缺血再灌注可促進(jìn)內(nèi)源性IGF-1的分泌，有助于缺血狀態(tài)下神經(jīng)組織的自我保護(hù)和修復(fù)，但這種促分泌作用維持時(shí)間不長。脈沖磁場和BYHWD干預(yù)后缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評(píng)分改善明顯、腦梗死面積減小，神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)和修復(fù)作用