補陽還五湯聯(lián)合MSCs移植對大鼠腦缺血再灌注損傷模型VEGF和Ki-67表達的影響.pdf

1、　　目的：采用 Zea-Longa 線栓法并加以改進建立局灶性腦缺血再灌注模型,從頸動脈注入骨髓間充質干細胞(MSCs),并給予補陽還五湯,應用免疫組化染色法觀察大鼠缺血再灌注模型缺血側血管內皮生長因子(VEGF)和增值細胞核抗原(Ki-67)的表達。來評價補陽還五湯聯(lián)合MSCs移植對修復腦缺血再灌注損傷模型大鼠血管及病變組織的作用,來探討補陽還五湯聯(lián)合骨髓間充質干細胞(MSCs)移植對腦缺血損傷的神經(jīng)保護機制。
　　方法：清

2、潔級成年健康 SD 大鼠,無菌條件下取出股骨和脛骨,DMEM 培養(yǎng)液沖出骨髓,200 目鋼網(wǎng)過濾。然后用密度梯度離心法分離獲取骨髓單個核細胞(mononuclear cells,MNCs),PBS洗兩次,將沉淀物加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液 10ml,輕輕吹打,做成細胞懸液,計數(shù),稀釋,按設計密度接種于 T-75培養(yǎng)瓶中,置于37℃、體積分數(shù)為5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中原代培養(yǎng)。待細胞鋪滿瓶底后用 25%胰蛋白酶消化傳代

3、,取第七代凍存移植。
　　采用“線栓法”制備 SD 大鼠短暫性腦缺血再灌注損傷模型,模型分為空白組、對照組、MSCs移植治療組和益氣活血方聯(lián)合MSCs移植治療組,每組15只。在造模缺血2小時再灌注1天后,取各組造模成功的不同給藥：益氣活血方聯(lián)合MSCs 移植治療組和 MSCs 移植治療組經(jīng)頸動脈注入 MSCs 懸液,空白組、對照組經(jīng)頸動脈注入等量生理鹽水。腦缺血模型空白組、對照組和 MSCs移植組分別灌胃生理鹽水(15ml/k

4、g體重),聯(lián)合組按同等的相應藥量灌服益氣活血湯藥。各組在造模前3天開始給藥,每日一次,連用7天。結束后斷頭取腦,取缺血再灌注損傷病灶處腦組織放入固定液中固定1h,脫水、透明、浸蠟,在海馬周圍連續(xù)制作腦部冠狀切片。
　　應用 HE 染色觀察細胞結構及形態(tài)；應用免疫組化染色法識別血管內皮生長因子(VEGF)和增值細胞核抗原(Ki-67)的表達,光鏡下記數(shù)。
　　結果：
　　1. HE 染色結果：假手術組神經(jīng)細胞

5、結構形態(tài)正常,核呈圓形或橢圓形,核和核仁明顯,胞漿無紅染,無細胞及間質水腫；模型組和移植組鏡下見大量神經(jīng)細胞變性、壞死、胞體皺縮,核固縮、碎裂、溶解,胞漿濃縮紅染,間質水腫明顯,炎癥細胞浸潤；聯(lián)合組神經(jīng)細胞變性、壞死數(shù)量減少與程度明顯減輕。
　　2. 空白組腦組織中VEGF幾乎不表達,對照組、MSCs移植治療組和益氣活血方聯(lián)合MSCs治療組與空白組相比,數(shù)目明顯增多,尤以益氣活血方聯(lián)合MSCs治療組表達最強。MSCs移植治療組

6、與對照比較P<0.05,益氣活血方聯(lián)合MSCs 治療組與對照組比較 P<0.01；益氣活血方聯(lián)合 MSCs 治療組與 MSCs 移植治療組比較P<0.05。
　　3. 空白組腦組織中 Ki-67幾乎不表達,對照組、MSCs 移植治療組和益氣活血方聯(lián)合 MSCs 治療組均可見到 Ki-67 表達,MSCs 移植治療組與對照組比較 P<0.05,益氣活血方聯(lián)合 MSCs 治療組與對照組比較 P<0.01；益氣活血方聯(lián)合MSCs治療

7、組與MSCs移植治療組比較P<0.05。
　　結論：
　　1. 采用密度梯度離心法獲取骨髓間充質干細胞( MSCs),將細胞經(jīng)過傳代培養(yǎng)使細胞得到擴增和純化的MSCs。
　　2. 短暫性腦缺血再灌注損傷動物模型的制備采用改良線栓法取得了較好效果,神經(jīng)行為學評分理想,癥狀很接近人表現(xiàn)。其簡便、易行,容易操作,很具有實用性,是制作腦缺血再灌注損傷動物模型理想的方法。
　　3. 應用免疫組化染色法證明了