殘余腎模型早期微血管改變和胎盤生長(zhǎng)因子表達(dá)的初步研究.pdf

1、多種人類疾病都有微血管病變的參與，但是微血管病變?cè)谀I臟病中的作用卻少有關(guān)注。既往對(duì)人類疾病和動(dòng)物模型的研究證明，內(nèi)皮細(xì)胞損傷可導(dǎo)致氧和營(yíng)養(yǎng)成份運(yùn)輸?shù)侥I小管、間質(zhì)的障礙，引起慢性缺血。慢性缺血繼而引起慢性缺氧，從而導(dǎo)致一系列病變，包括：肌成纖維細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)合成和誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡，最終導(dǎo)致腎臟纖維化、腎功能減退。用血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VascularEndothelialGrowthFactor,VEGF)治療大鼠殘腎模型促進(jìn)腎小球和

2、腎小管周圍毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，可明顯改善腎功能，而且膠原Ⅲ合成減少。因此，維護(hù)微循環(huán)的穩(wěn)定對(duì)腎功能保護(hù)有重要意義，改善微血管病變可以延緩腎功能減退。 既往對(duì)大鼠殘余腎模型的研究發(fā)現(xiàn)，8周后腎功能呈進(jìn)行性惡化。有趣的是，在模型早期可能有短暫的微血管反應(yīng)。盡管Kang等人認(rèn)為VEGF丟失和抗血管生長(zhǎng)因子(Thrombospondin-1，TSP-1)表達(dá)上調(diào)在該模型中發(fā)揮著一定的作用，但內(nèi)皮細(xì)胞增生的具體機(jī)制尚不清楚。 胎

3、盤生長(zhǎng)因子(PlacentaGrowthFactor,PlGF)，是VEGF家族中的新成員。近年來發(fā)現(xiàn)PlGF可以結(jié)合其受體VEGFR-1(Flt-1)，傳導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，對(duì)病理性微血管發(fā)生有促進(jìn)作用，但不影響其生理過程。相反，阻斷VEGFR-1可以改善以微血管過渡生長(zhǎng)為特征的疾病，如：可以抑制腫瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的血管新生。近來基因研究證明，PlGF和VEGFR-1是介導(dǎo)病理性血管增生的唯一關(guān)鍵因素。這些均表明，PlGF對(duì)微血管增生有

4、重要意義。 PlGF在殘余腎模型早期階段微血管反應(yīng)中的作用尚不清楚。因此，本研究探討：①大鼠殘余腎模型早期腎功能變化的特征；②大鼠殘腎模型早期微血管病變，及其與腎功能代償之間的相關(guān)關(guān)系；③大鼠殘余腎模型早期PlGF的表達(dá)。 第一章大鼠殘余腎模型早期腎功能變化的觀察一、目的探討大鼠殘余腎模型早期腎功能和血壓的變化規(guī)律。 二、材料和方法1.模型建立48只SD大鼠隨機(jī)分成兩組：假手術(shù)組和殘腎模型組。24只大鼠行5/6腎

5、切除手術(shù)：結(jié)扎右側(cè)腎動(dòng)脈并結(jié)扎左側(cè)腎動(dòng)脈三個(gè)分支中的兩只。同時(shí)，24只大鼠行假手術(shù)，開腹，觸其左腎，關(guān)腹。每周測(cè)體重。假手術(shù)組和殘腎組在手術(shù)后第1、2、3、4周各殺六只大鼠。實(shí)驗(yàn)方案得到中山大學(xué)動(dòng)物委員會(huì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指南的允許。 2.血壓、尿素氮、肌酐的檢測(cè)應(yīng)用電腦自動(dòng)血壓心率儀(日本SoftronBP-98A)，采用尾套法，每周檢測(cè)尾動(dòng)脈收縮壓。肌酐檢測(cè)采用苦味酸法檢測(cè)，由腎病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量資料用均數(shù)士標(biāo)

6、準(zhǔn)差表示，組間差異比較用單因素方差(one-wayANOVA)分析，以P＜0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)均用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。 三、結(jié)果模型建立后，假手術(shù)組大鼠的體重隨著時(shí)間進(jìn)展持續(xù)上升，而殘余腎模型組大鼠體重明顯低于假手術(shù)組，到實(shí)驗(yàn)第四周時(shí)，假手術(shù)組大鼠的體重約是殘腎組大鼠體重的1.3倍。 模型后第一周，殘腎組大鼠的BUN、Scr和血壓明顯上升，但其后第2周到第4周，上述指標(biāo)一直都維持在穩(wěn)定水平，而不

7、是持續(xù)性進(jìn)展。假手術(shù)組大鼠的BUN、Scr和BP則無明顯變化。 四、小結(jié)殘余腎模型早期，大鼠腎功能和血壓維持穩(wěn)定，而不是持續(xù)進(jìn)展，提示有代償機(jī)制的參與。 第二章大鼠殘余腎模型早期微血管病變一、目的觀察大鼠殘余腎模型早期微血管改變，并探討腎功能改變和微血管反應(yīng)之間的關(guān)系。 二、材料和方法1.免疫組化染色腎組織石蠟切片行免疫組化染色，內(nèi)皮細(xì)胞用小鼠抗大鼠內(nèi)皮細(xì)胞單克隆抗體(RECA-1)標(biāo)記。殘腎組和假手術(shù)組腎組織石

8、蠟切片用RECA-1單抗和小鼠抗增生細(xì)胞核抗原(PCNA)單抗(PC10)行免疫雙重免疫組織化學(xué)染色，雙重染色陽性細(xì)胞(RECA-1+PCNA+細(xì)胞)為增生的內(nèi)皮細(xì)胞。 2.免疫組化的量化每只動(dòng)物計(jì)算至少20個(gè)高倍視野(×400)腎小球橫切面(glomerularcrosssection，gcs)中毛細(xì)血管數(shù)并求得平均值，得出腎小球毛細(xì)血管指數(shù)(glomerularcapillaryindex，GCI)；計(jì)算腎皮質(zhì)至少20個(gè)顯微

9、鏡高倍視野(hpf)(×400)腎小管周圍毛細(xì)血管指數(shù)(peritubularcapillaryindex，PCI)。同時(shí)計(jì)算至少20個(gè)腎小球橫切面和至少20個(gè)高倍視野(×400)中RECA-1+PCNA+細(xì)胞(增生內(nèi)皮細(xì)胞)數(shù)，并求和取平均值，得每個(gè)腎小球橫切面的增生內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)的均值。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量資料用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異比較用單因素方差(one-wayANOVA)分析，以P＜0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)均

10、用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。 三、結(jié)果1.大鼠殘余腎模型早期微血管改變與假手術(shù)組相比，殘腎組平均每個(gè)腎小球橫截面的RECA-1+毛細(xì)血管襻呈上升趨勢(shì)，但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相反，殘腎組腎小管平均周圍毛細(xì)血管密度術(shù)后明顯降低，直到第四周。 2.大鼠殘余腎模型早期微血管增生改變殘腎組腎小球毛細(xì)血管增生在模型建立后明顯上調(diào)，第二周時(shí)達(dá)到高峰，平均每個(gè)腎小球橫截面的RECA-1+PCNA+較假手術(shù)大鼠升高約3倍。腎小管周圍內(nèi)

11、皮細(xì)胞增生也在第一周時(shí)達(dá)高峰，此后開始下降，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，腎小球和腎小管周圍內(nèi)皮細(xì)胞增生都回到基線水平。 四、小結(jié)1.大鼠殘余腎模型早期有顯著的微血管反應(yīng)； 2.微血管反應(yīng)出現(xiàn)在腎功能的穩(wěn)定階段； 3.這種微血管反應(yīng)參與了延緩早期的腎臟病變進(jìn)展。 第三章殘腎模型早期胎盤生長(zhǎng)因子的表達(dá)一、目的探討大鼠殘腎模型早期腎組織PlGF的表達(dá)。 二、材料和方法1.細(xì)胞培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞和巨噬細(xì)胞放

12、入培養(yǎng)條件為37℃，95％空氣和5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱。這三種細(xì)胞株，分別用DMEM(腎小管上皮細(xì)胞)和RPMI1640(系膜細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)培養(yǎng)基。 2.RT-PCR腎組織提總RNA，RT-PCR檢測(cè)胎盤生長(zhǎng)因子(PlGF)mRNA的表達(dá)，以β-Actin為內(nèi)參照，計(jì)算相對(duì)單位，并與假手術(shù)組比較。 3.WesternBlot取左腎組織蛋白，WesternBlot檢測(cè)PlGF的表達(dá)，以β-Actin為內(nèi)參照，計(jì)算與內(nèi)參照

13、比值，并與假手術(shù)組比較。 4.統(tǒng)計(jì)分析計(jì)量資料用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異比較用單因素方差(one-wayANOVA)分析，以P＜0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)均用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。 三、結(jié)果1.腎組織PlGFmRNA表達(dá)RT-PCR結(jié)果顯示，PlGFmRNA表達(dá)在第一周和第二周，較假手術(shù)組相比，分別上調(diào)2.8倍和2.7倍。第四周時(shí)，PlGFmRNA表達(dá)回復(fù)到基線水平。 2.腎組織PlGF蛋白表

14、達(dá)Westernblot結(jié)果顯示，假手術(shù)組僅有微量的PlGF蛋白表達(dá)。與假手術(shù)組比較，殘腎組PlGF蛋白表達(dá)在第一周和第二周上調(diào)3.9和3.2倍。 3.腎細(xì)胞PlGF蛋白表達(dá)Westernblot結(jié)果顯示，腎小管上皮細(xì)胞PlGF蛋白表達(dá)最強(qiáng)。巨噬細(xì)胞PlGF蛋白表達(dá)最弱。系膜細(xì)胞表達(dá)居于兩者之間。 四、小結(jié)1.PlGF可能是大鼠殘余腎模型中微血管發(fā)生的主要?jiǎng)恿Γ?2.腎小管上皮細(xì)胞是PlGF的主要來源。