應(yīng)用酵母雙雜系統(tǒng)篩選與MOG1相互作用的蛋白.pdf

1、心臟鈉通道的α亞基Nav1.5在心臟動(dòng)作電位的產(chǎn)生和傳導(dǎo)過程中起著重要的作用,其基因突變會(huì)導(dǎo)致惡性心律失常或猝死。2008年王擎研究小組通過酵母雙雜交技術(shù)篩選出與Nav1.5相互作用的蛋白質(zhì)MOG1,發(fā)現(xiàn)MOG1可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜SCN5A的表達(dá)而影響鈉電流密度,揭示了MOG1對(duì)心臟鈉離子通道具有重要調(diào)節(jié)作用。最近又發(fā)現(xiàn)MOG1基因突變可直接導(dǎo)致Brugada綜合征。目前有關(guān)MOG1在心臟中的生理功能尚不清楚,為了探討MOG1在心臟中的

2、功能及其調(diào)控心臟鈉通道的分子機(jī)制,本研究應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與MOG1相互作用的蛋白質(zhì),希望通過此途徑找到突破點(diǎn)。
　　實(shí)驗(yàn)首先以p3×FLAG-CMV-7.1-MOG1為模板擴(kuò)增得到MOG1全長cDNA,構(gòu)建誘餌載體pGBKT7-MOG1。將其轉(zhuǎn)化酵母AH109細(xì)胞檢測是否激活報(bào)告基因表達(dá),再將其轉(zhuǎn)化酵母Y187細(xì)胞檢查其表達(dá)情況和細(xì)胞毒性作用。然后將pGBKT7-MOG1和人胎腦cDNA文庫進(jìn)行Yeast Mating,通過

3、營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基和α-gal分析來篩選陽性克隆。將得到的148個(gè)陽性克隆再一次進(jìn)行營養(yǎng)篩選,經(jīng)過α-gal分析、PCR分類、回復(fù)性實(shí)驗(yàn)排除假陽性克隆。然后將候選陽性克隆測序,并把測序結(jié)果在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比對(duì),最終確定兩種可能和MOG1相互作用的蛋白:EPB42(Erythrocyte membrane protein band4.2)、BTBD6( BTB(POZ) domain containing6)。
　　綜上所述,本實(shí)