核轉(zhuǎn)錄因子κB在調(diào)控鈣網(wǎng)蛋白基因缺陷細胞中MMPs表達的研究.pdf

1、背景：
　　鈣網(wǎng)蛋白（Calreticulin,CRT）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和肌漿網(wǎng)中主要的鈣結(jié)合蛋白，具有調(diào)控細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)、分子伴侶、蛋白質(zhì)修飾和合成等多種功能，參與生物體內(nèi)多種生理和病理過程，與心臟發(fā)育和多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)鈣網(wǎng)蛋白基因缺失（calreticulin null,crt-/-）胚胎小鼠可出現(xiàn)心臟發(fā)育不全，心室壁變薄，甚至胎死宮內(nèi)，原因可能與細胞外基質(zhì)含量變化有關(guān)；基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix

2、 Metalloproteinases,MMPs）是一組能降解細胞外基質(zhì)與膠原的鋅依賴蛋白酶家族，在調(diào)節(jié)心臟細胞外基質(zhì)與膠原方面具有重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)與野生型（wide type,wt）胚胎小鼠成纖維細胞（mouse embryonic fibroblast,MEF）比較，crt-/-胚胎小鼠成纖維細胞MMP-2活性表達增高，而MMP-9的活性表達明顯減弱，這可能是crt-/-小鼠心臟發(fā)育不全的原因之一，但是具體機制尚未闡明

3、。前期研究還發(fā)現(xiàn)在細胞核而不是在細胞漿中，與wt株相比，crt-/-細胞株中核轉(zhuǎn)錄因子κB（Nuclear factorκB,NF-κB）的表達是明顯下降的（P<0.05），我們推測NF-κB信號通路參與了MMP-2/-9的活性表達，導(dǎo)致心肌細胞外間質(zhì)與膠原含量的改變，從而引起心室壁變薄，心臟發(fā)育不全。
　　目的：
　　體外培養(yǎng)胚胎小鼠成纖維細胞（Mouse embryonic fibroblast cells,MEF)野生

4、株（wide type,wt）和鈣網(wǎng)蛋白基因敲除株（calreticulin null,crt），基于前期研究，探討NF-κB信號通路是否參與鈣網(wǎng)蛋白基因缺失型細胞MMP-2和MMP-9活性的改變以及調(diào)節(jié)機制，為闡明心臟形成、發(fā)育及相關(guān)病理過程提供新的理論依據(jù)，并為臨床疾病的治療提供新的方向。
　　方法：
　　在體外培養(yǎng) wt及 crt-/-胚胎小鼠成纖維細胞，分別加入不同濃度的腫瘤壞死因子α（tumor necrosis

5、factor-α,TNF-α）（0.1、1、10、100、200、400、800ng/ml）作用24小時后收集培養(yǎng)基和細胞總RNA備用；然后再分別加入TNF-α（10、100ng/ml）作用1、6、12、18、24小時后收集培養(yǎng)基和細胞總 RNA，對收集的細胞培養(yǎng)基超濾濃縮離心，利用明膠酶譜法及實時定量PCR（Real-time Quantitative PCR,QRT-PCR），分別從蛋白活性及基因水平上觀察MMP-2和MMP-9的改

6、變。
　　結(jié)果：
　　1. NF-κB激動劑對MMP-2和MMP-9活性的影響
　　給予不同濃度TNF-α作用24小時后，crt細胞的MMP-9活性與對照組比較逐漸升高（P<0.01），并在TNF-α的濃度為100ng/ml時，MMP-9活性達到最高值；而crt細胞的MMP-2活性和wt細胞的MMP-2及MMP-9活性均未見明顯變化。
　　給予10ng/ml和100ng/ml的TNF-α作用不同時間后，細胞的MM

7、P-9活性與對照組比較逐漸升高（P<0.05或P<0.01），而crt細胞的MMP-2活性和wt細胞的MMP-2及MMP-9活性均未見明顯變化。
　　2.NF-κB激動劑對MMP-2和MMP-9的mRNA水平的影響
　　給予不同濃度（100、400ng/ml）TNF-α作用24h后，crt-/-細胞的MMP-9 mRNA水平和wt細胞MMP-2mRNA水平與對照組比較明顯升高（P<0.05），而wt細胞MMP-9 mRNA水

8、平和crt-/-細胞的MMP-2 mRNA水平未見明顯變化。
　　給予100ng/ml的TNF-α作用不同時間后，crt-/-細胞的MMP-9 mRNA水平與對照組比較逐漸升高（P<0.05或P<0.01），而其MMP-2 mRNA水平未見明顯變化；wt細胞的MMP-9 mRNA水平與對照組比較有所變化（P<0.05），而其MMP-2 mRNA水平未見明顯變化。
　　結(jié)論：
　　1. NF-κB信號通路參與了crt-/