TAT-水牛iPS細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白原核表達(dá)研究.pdf

1、誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)，是指將特定轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入分化的體細(xì)胞，使其被重編程為具有多能性狀態(tài)，類(lèi)似于ES細(xì)胞的多能性干細(xì)胞。本研究探討了將穿膜肽與轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行融合表達(dá)，以建立一種非轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)水牛iPSCs的方法。本試驗(yàn)通過(guò)PCR亞克隆了水牛的四個(gè)iPS細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子(Oct4、Sox2、cMyc、Klf4)，構(gòu)建了原核表達(dá)載體，并對(duì)目的蛋白進(jìn)行了純化，結(jié)果如下：
　　

2、 1、根據(jù)NCBI上檢索到的HA2（流感病毒血凝素2蛋白）和TAT(HIV病毒轉(zhuǎn)錄活化因子)序列，人工合成了優(yōu)化的HA2-TAT，然后連接到原核表達(dá)載體pET-32a(+)上，成功改造為基礎(chǔ)表達(dá)載體pET-HA2-TAT。
　　 2、通過(guò)PCR亞克隆水牛的四個(gè)iPS細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子(Oct4、Sox2、cMyc、Klf4)，并定向克隆到pET-HA2-TAT，成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-NLS-Oct4-TAT、pET-NLS-

3、Sox2-TAT、pET-NLS-cMyc-TAT、pET-NLS-KIf4-TAT。
　　 3、將原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)或Transetta(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)了目的蛋白：NLS-Oct4-TAT蛋白(61.4kDa)、NLS-Sox2-TAT蛋白(57.7kDa)、NLS-cMyc蛋白(71.6kDa)，并優(yōu)化了各自的表達(dá)條件和純化條件。
　　 4、構(gòu)建了pET-EGFP、pET-NLS-EGFP-