LPS對人牙周韌帶細胞核轉(zhuǎn)錄因子-κB表達及炎性細胞因子分泌的研究.pdf

1、目的：通過體外培養(yǎng)獲得人牙周韌帶細胞(human periodontal ligament cells，HPDLCs)，并通過觀察脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)對HPDLCs增殖及分泌腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)以及白細胞介素-8(intedeukin-

2、8，IL-8)的影響，觀察LPS作用HPDLCs后核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuelearfactor kappa B，NF-κB)的表達情況，探討LPS在牙周炎發(fā)病過程中的作用，為尋找預(yù)防和藥物治療牙周炎的新途徑提供理論依據(jù)。 方法：收集12-28歲因正畸拔除的健康前磨牙60例，采用組織塊直接貼壁培養(yǎng)法體外分離培養(yǎng)HPDLCs，并行人牙周韌帶細胞來源鑒定。將HPDLCs分為兩組，即實驗組和對照組：分別置于含有不同濃度LPS(實驗組：0

3、.01μg/ml、O.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml及100μg/ml對照組0μg/ml)的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，MTT法檢測HPDLCs增殖情況。選用10μg/ml的LPS作用HPDLCs 24h后，分別檢測LPS作用HPDLCs前后其堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活性。選用10μg/ml的LPS刺激HPDLCs，并采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinked immunosorbent

4、assay，ELISA)分別檢測LPS刺激前及刺激3h、6h、24h、48h后細胞上清液中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-8的表達情況。選用10μg/ml的LPS刺激HPDLCs 24h，用免疫熒光法檢測LPS刺激前后HPDLCs中NF-κB的表達情況。多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗。檢驗標準α=0.05，結(jié)果以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1.體外培養(yǎng)HPDLCs60

5、例，成功15例，成功率為25％。經(jīng)免疫組化染色顯示所培養(yǎng)細胞抗角蛋白染色陰性，抗骨橋素(osteopontin，OPN)染色陽性，證明細胞非上皮來源，并具有成骨特性。 2.低于1μg/ml濃度的LPS可促進HPDLCs的增殖，其中促進作用最為明顯的濃度為0.01μg/ml(P<0.05)，隨著濃度的增加促進作用逐漸下降；LPS濃度達到10μg/ml和100μg/ml時對HPDLCs增殖則無影響(P>0.05)。 3.LP

6、S作用24h后HPDLCs的ALP活性明顯下降(P<0.01)。 4.LPS刺激HPDLCs3h后即可檢測到TNF-α、IFN-γ以及IL－1β分泌量均明顯升高(P<0.05)，并隨作用時間延長逐漸升高，到24h達到高峰；隨后三種細胞因子分泌量均逐漸下降，至48h時IFN－γ和IL－1β仍維持一較高水平(P<0.05)，而TNF-α分泌量則恢復(fù)至刺激前水平(P>0.05)。LPS刺激HPDLCs3h和6h檢測IL－8的分泌受到明

7、顯抑制(P<0.05)，隨后才出現(xiàn)時間依賴性增加，直至24h后IL－8分泌量才高于刺激前水平，到48h達到頂峰(P<0.05)。 5.LPS作用前免疫熒光檢測NF－κB主要表達于細胞漿中，胞漿內(nèi)有較強的熒光顯示，細胞核熒光較弱；LPS作用后NF－κB發(fā)生了明顯的核轉(zhuǎn)位，在細胞核內(nèi)熒光明顯加強，細胞漿內(nèi)熒光減弱。 結(jié)論： 1.組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)HPDLCs簡便且成功率較高，第4-8代細胞具有較高的增殖活性，適用于相關(guān)