鈣調(diào)控蛋白與核因子κB在MDMA急性染毒心肌細胞鈣失衡作用的研究.pdf

1、目的：
　　MDMA在世界范圍內(nèi)流行，其毒性研究已受到廣泛關(guān)注，是法醫(yī)學關(guān)注的焦點之一。吸食和濫用MDMA可引起包括心動過速、室性心律失常，并引起心肌細胞形態(tài)學的病理性改變，如擴張性心肌病、肥厚性心肌病樣改變，引起猝死等，表明心臟亦是MDMA的毒性作用靶器官之一。MDMA可引起心肌細胞內(nèi)的鈣超載及振蕩模式改變、核因子κB的活化，基于此，在本課題中，我們研究了不同濃度MDMA急性染毒時細胞內(nèi)鈣離子濃度及鈣振蕩模式的變化特征及差異，并

2、觀察涉及維持細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)的鈣調(diào)控蛋白在MDMA致心肌細胞鈣超載中的作用，以及NF-κB活化的可能途徑及其對鈣調(diào)控蛋白的影響，進一步探討MDMA致心肌毒性的作用機制。
　　方法：
　　實驗1：
　　1.采用原代大鼠心肌細胞體外培養(yǎng)，至培養(yǎng)第6d時，建立MDMA急性染毒模型及對照組，染毒組分為10μmol、100μmol及1000μmol三組，染毒1h后，觀察其形態(tài)變化，測定其細胞毒性；
　　2.在細胞培養(yǎng)第6天

3、，使用負載Fluo4-AM的熒光染液，利用激光共聚焦顯微鏡觀察染毒心肌細胞內(nèi)鈣信號的變化特征。
　　實驗2：
　　采用原代大鼠心肌細胞，于體外培養(yǎng)第6d染毒，提取細胞總蛋白及總RNA，使用蛋白免疫印跡法及熒光實時定量 PCR法檢測 RyR2、SERCA2a、PLN、NCX1及Cav1.2（CACNA1c）的蛋白及基因表達變化。
　　實驗3：
　　1. EMSA法檢測MDMA染毒組、PDTC（NF-κB抑制劑）干預

4、組及CHE（PKC抑制劑）干預組，觀察各組中NF-κB的活性變化。
　　2.提取各組中核蛋白及總蛋白，觀察p-p65（Ser311）的含量變化，并觀察PKCζ的含量變化。
　　3.利用激光共聚焦技術(shù)，觀察 PDTC干預后，MDMA染毒對心肌細胞內(nèi)鈣信號的變化情況。
　　4.提取MDMA染毒及PDTC干預組的總蛋白及總RNA，使用蛋白免疫印跡法及熒光實時定量PCR法檢測PDTC干預后，MDMA染毒時RyR2、SERCA2

5、a、PLN、NCX1及Cav1.2（CACNA1c）的蛋白及基因表達變化。
　　結(jié)果：
　　1. MDMA染毒后心肌細胞形態(tài)未見明顯改變，部分可見細胞搏動減緩，LDH法測定結(jié)果顯示各濃度MDMA急性染毒組與正常心肌細胞對照組之間無明顯差異。
　　2.空白對照組Ca2+振蕩波形為不規(guī)則狀波動，但總體振蕩幅度小，未見明顯的大幅波動，相對光密度值變化較小，而在MDMA急性染毒組，可見胞漿內(nèi)Ca2+振蕩波形呈不規(guī)則改變，振蕩波

6、動波幅增大，搏動振蕩劇烈，頻率不規(guī)則，相對光密度值波動幅度增大，部分波寬有所增加，但各濃度之間未見明顯的差異。
　　3. MDMA染毒時，心肌細胞內(nèi)的RyR2、SERCA2a及NCX1的蛋白及基因表達均上調(diào)，而LTCC通道、PLN的蛋白及基因表達下調(diào)，且有劑量依賴性。
　　4. EMSA法顯示MDMA染毒時，NF-κB活性增加，并可被PDTC及CHE抑制。
　　5.在MDMA染毒組中，PKCζ及核內(nèi)p-p65（Ser3

7、11）含量均有所上升，并可被CHE抑制。
　　6. PDTC干預、阻斷NF-κB后，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)鈣離子信號變化，可見鈣振蕩波幅較染毒組減低。
　　7. PDTC干預、阻斷NF-κB后，RyR2及SERCA2a、NCX1 mRNA及蛋白表達較MDMA染毒時有所下降，PLN無明顯變化，而Cav1.2（CACNA1c）的表達上調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1. MDMA可以導致心肌細胞內(nèi)鈣信號的變化，鈣離子濃度升