先天性小耳畸形殘耳軟骨細(xì)胞與脂肪干細(xì)胞共培養(yǎng)構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分殘耳軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞向軟骨分化的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：研究ADSCs的體外生長(zhǎng)的生物學(xué)特性及其作為軟骨組織工程種子細(xì)胞的可行性。
　　 方法：利用先天性小耳畸形患者外耳再造手術(shù)中廢棄的殘耳軟骨組織與脂肪組織,膠原酶消化法從組織中提取脂肪干細(xì)胞,體外傳代培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究:細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察,細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定,流式細(xì)胞儀檢測(cè)脂肪干細(xì)胞表面標(biāo)志物,多向分化誘導(dǎo)檢測(cè),其向軟骨、骨、脂肪及內(nèi)皮多向分化誘導(dǎo)能力檢測(cè)。膠

2、原酶消化法從組織中提取殘耳軟骨細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞,脂肪干細(xì)胞與殘耳軟骨細(xì)胞隔離共培養(yǎng),檢測(cè)殘耳軟骨細(xì)胞微環(huán)境能否誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞向軟骨方向分化:Alcian Blue染色；RT—PCR檢測(cè)CollagenⅡ基因及Aggrecan基因的表達(dá)。
　　 結(jié)果：ADSCs呈成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng),生長(zhǎng)旺盛；流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示:CD44,CD105陽(yáng)性,CD34,CD45,CD106,CD117為陰性；成骨誘導(dǎo)茜素紅染色顯示鈣化基質(zhì)沉積表達(dá)；成脂肪

3、誘導(dǎo)油紅-0染色陽(yáng)性,胞漿內(nèi)見脂滴形成；成軟骨誘導(dǎo)細(xì)胞聚集成小團(tuán)塊,番紅0染色顯示蛋白聚糖表達(dá)陽(yáng)性。
　　 結(jié)論成功分離培養(yǎng)出脂肪干細(xì)胞,ADSCs生長(zhǎng)增殖能力強(qiáng),高表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)抗原,可長(zhǎng)期傳代,具有多向分化潛能可向軟骨,骨,脂肪等多個(gè)方向分化,可作為組織工程軟骨構(gòu)建的種子細(xì)胞。殘耳軟骨細(xì)胞能夠在體外模擬軟骨誘導(dǎo)微環(huán)境,促進(jìn)ADSCs向軟骨分化。
　　 第二部分殘耳軟骨細(xì)胞與脂肪干細(xì)胞共培養(yǎng)體內(nèi)構(gòu)建軟骨的實(shí)驗(yàn)研究

4、>　　 目的：殘耳軟骨細(xì)胞與ADSCs在裸鼠體內(nèi)構(gòu)建組織工程軟骨最佳細(xì)胞比的初步研究。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)分組:第2代殘耳軟骨細(xì)胞與第3代ADSCs以1:9的比例混合作為實(shí)驗(yàn)組(Exp1),以3:7的比例混合作為實(shí)驗(yàn)組(Exp2),以5:5的比例混合作為實(shí)驗(yàn)組(Exp3),單純殘耳軟骨細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照組(Ctrl.1),單純ADSCs作為陰性對(duì)照組(Ctrl.2),Exp1、Exp2、Exp3、Ctrl.1和Ctrl.2組接種細(xì)

5、胞終濃度為5.0×107/ml,單純低密度殘耳軟骨細(xì)胞對(duì)照組(Ctrl.3)細(xì)胞終濃度為2.5×107/ml。每組按各自的細(xì)胞濃度將0.2ml的細(xì)胞量與Pluronic—F127復(fù)合物混合后注射到裸鼠背部皮下,每組接種6只裸鼠。體內(nèi)培養(yǎng)10周后取材,通過對(duì)新生組織的大體觀察、濕重比較、糖胺多糖含量測(cè)定、組織學(xué)及免疫組化染色檢測(cè)以及Realtime PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá),初步找到體內(nèi)構(gòu)建組織工程軟骨殘耳軟骨細(xì)胞與ADSCs之間的最佳比例

6、。
　　 結(jié)果：Exp2、Exp3組與Ctrl.1組注射部位形成白色軟骨樣組織,3組新生組織的大小相仿,外觀和彈性與正常軟骨相似；Ctrl.2組形成纖維樣組織,質(zhì)軟,色淡黃；Exp1.、Ctrl.3組形成的軟骨樣組織表面光澤度及彈性差,新生組織量也明顯較Exp2、Exp3組與Ctrl.1組少。Exp2、3組平均濕重分別達(dá)到達(dá)到Ctrl.1組的87％及88.7％；Exp1、Ctrl.3組平均濕重分別低于Ctrl.1組平均濕重的33

7、％及40％；Exp2、Exp3組平均GAG含量達(dá)到Ctrl.1組的90％以上；Exp2、Exp3組和Ctrl.1組的平均濕重和GAG平均含量均顯著高于Exp1、Ctrl.2組和Ctrl.3組(P<0.05)。組織學(xué)染色:Exp1、Exp2、Exp3組、Ctrl.1組與Ctrl.3組標(biāo)本均有軟骨陷窩形成,Exp1、Ctrl.3組與Exp2、Exp3、Ctrl.1組相比較,軟骨陷窩松散排列不均,軟骨陷窩較大；Ctrl.2組為纖維樣組織,未見

8、軟骨陷窩形成。Ⅱ型膠原免疫組化染色:Exp1、Exp2、Exp3組、Ctrl.1組與Ctrl.3組標(biāo)本均可見成熟軟骨陷窩周圍有不同程度的棕黃色沉淀即Ⅱ型膠原表達(dá)；Ctrl.2組未見Ⅱ型膠原表達(dá)。共移植組(Exp2)和共移植組(Exp3)在相關(guān)基因表達(dá)方面與陽(yáng)性對(duì)照組(Ctrl.1)相近似(p>0.05),而ADSCs對(duì)照組(Ctrl.2)及低密度殘耳軟骨細(xì)胞對(duì)照組(Ctrl.3)以及共移植組(Exp1)與陽(yáng)性對(duì)照組(Ctrl.1)在相關(guān)