體外共培養(yǎng)方法誘導(dǎo)兔脂肪干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞方向分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 由于軟骨的組織學(xué)特點(diǎn)及其無(wú)神經(jīng)和血管的營(yíng)養(yǎng),在正常的生理環(huán)境中,關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)是很困難的。應(yīng)用生物相容性聚合物與細(xì)胞復(fù)合構(gòu)建組織功能性軟骨以及刺激誘導(dǎo)軟骨形成都是修復(fù)軟骨缺損的方法。在軟骨再生中,自體軟骨細(xì)胞是很有用的,但是其作用卻受制于終末分化的軟骨細(xì)胞增殖能力和纖維性軟骨形成等因素。因此,在軟骨組織工程中,在干細(xì)胞的應(yīng)用方面,開(kāi)展了許多研究。近來(lái),脂肪源性干細(xì)胞(adipose-derived stem c

2、ells,ADSCs)因其具有自我更新能力、長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)胞生存能力以及多向分化潛能而成為關(guān)節(jié)透明軟骨修復(fù)和再生的種子細(xì)胞。另外,ADSCs還具有能夠在局麻下從身體不同部位大量獲取的優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)研究的目的是通過(guò)一種創(chuàng)新的脂肪干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞共培養(yǎng)方法,誘導(dǎo)兔脂肪干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞方向分化,通過(guò)各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè),在實(shí)踐中檢驗(yàn)該共培養(yǎng)方法的可行性,并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　 材料和方法
　　 1.取3-4月齡健康新西蘭大

3、白兔,3％戊巴比妥耳緣靜脈麻醉,無(wú)菌取出腎周脂肪組織,Ⅰ型膠原酶酶解法分離出脂肪源性干細(xì)胞(adipose-derived stemcells,ADSCs),進(jìn)行體外原代培養(yǎng),傳代后差速貼壁培養(yǎng)純化。流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志CD49d,CD105,CD34,CD106的表達(dá)。
　　 2.無(wú)菌切取3-4月齡新西蘭大白兔膝關(guān)節(jié)非負(fù)重區(qū)關(guān)節(jié)軟骨及關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜,將軟骨剪成1-3mm3薄片,先以0.25％胰蛋白酶消化30-35分鐘,再以0

4、.1％的Ⅱ型膠原酶消化6-8小時(shí),過(guò)濾、離心收集、計(jì)數(shù),以2×106個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi):將滑膜剪碎,4mg/m1Ⅰ型膠原酶消化、過(guò)濾、離心收集、計(jì)數(shù)后,以1×105個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。將兩種細(xì)胞分別體外常規(guī)培養(yǎng)與擴(kuò)增,第三代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
　　 3.取第三代的ADSCs,根據(jù)誘導(dǎo)方式不同分為三組:Ⅰ組空白對(duì)照組,不加任何誘導(dǎo);Ⅱ組軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)組滴加軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液(組成:TGF-β110n g/ml

5、、bFGF-25ng/ml、Vc50μg/ml、Dexamethasone10-7M/L);Ⅲ組共培養(yǎng)組取35mm×10mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)的第三代脂肪干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞,將三個(gè)皿放入一個(gè)200mm×20mm培養(yǎng)皿中,成“品”字形擺放,在大皿中加入培養(yǎng)基(加10％胎牛血清)培養(yǎng)。收集三組中的脂肪干細(xì)胞,提取mRNA,反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)(RT-PCR)產(chǎn)物電泳及熒光定量PCR檢測(cè)SOX-9、Aggrecan、TtypeⅡ coll

6、agen的表達(dá)。
　　 結(jié)果
　　 1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),原代細(xì)胞接種后24小時(shí)可見(jiàn)少量細(xì)胞貼壁,呈短梭形。48小時(shí)后多數(shù)細(xì)胞已貼壁并開(kāi)始伸展,分裂,出現(xiàn)由單個(gè)細(xì)胞分裂形成的集落。換液2-3次之后,大多數(shù)漂浮細(xì)胞被清除。5-7天后,細(xì)胞逐漸分裂、增殖,形成多個(gè)細(xì)胞克隆。傳代細(xì)胞貼壁快,7-8天形成單層,細(xì)胞核大,胞漿內(nèi)顆粒多,呈平行或漩渦狀生長(zhǎng)。
　　 2.ADSCs免疫表型流式測(cè)定流式細(xì)胞學(xué)

7、分析顯示,CD49d和CD105均呈陽(yáng)性表達(dá),CD34和CD106均呈陰性表達(dá)。
　　 3.RT-PCR電泳及熒光定量PCR檢測(cè):在分組培養(yǎng)后的第7天和第14天,三個(gè)目的基因中只有SOX-9、Aggrecan表達(dá),第21天,三個(gè)目的基因都有表達(dá)。共培養(yǎng)組SOX-9和TypeⅡ collagen的表達(dá)水平均高于誘導(dǎo)組,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;兩組在Aggrecan的表達(dá)水平上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論
　　 1.ADSCs

8、適合成為軟骨組織工程的種子細(xì)胞。取材方便,Ⅰ型膠原酶酶解法分離可以獲取大量脂肪干細(xì)胞,體外培養(yǎng)性能穩(wěn)定,易于傳代擴(kuò)增,在體外增殖多代之后仍具有完好的細(xì)胞特異性標(biāo)志,并繼續(xù)保持分化的能力。
　　 2.軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞可分泌多種生長(zhǎng)因子如:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β、胰島素樣生長(zhǎng)因子IGF等。這些因子是公認(rèn)的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)軟骨分化誘導(dǎo)因子,這些可溶性因子可能在ADSCs軟骨形成過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。
　　 3.本實(shí)驗(yàn)