糖蛋白pIgR兩種新功能的發(fā)現(xiàn)研究.pdf

1、多聚免疫球蛋白受體(pIgR)屬于I型跨膜糖蛋白,可以與多聚免疫球蛋白A和多聚免疫球蛋白M特異性結(jié)合,通過穿胞轉(zhuǎn)運,將它們從上皮細胞基底側(cè)膜轉(zhuǎn)運到頂膜,并最終分泌到外分泌液中去。pIgR通過介導(dǎo)細胞內(nèi)多聚免疫球蛋白的轉(zhuǎn)運,可以在粘膜的腔面阻止病原體粘附,在上皮細胞內(nèi)中和病毒,也可以將固有層內(nèi)的抗原分泌出去。因此,pIgR的有效分泌是多聚免疫球蛋白發(fā)揮粘膜防御功能的必要條件,在粘膜免疫中起著舉足輕重的作用。最初對人小腸粘膜的免疫組織化學(xué)研

2、究發(fā)現(xiàn):人小腸pIgR分布于柱狀吸收細胞,尤其是那些分布在腸隱窩內(nèi)的吸收細胞,而潘氏細胞、杯狀細胞、內(nèi)分泌細胞均未發(fā)現(xiàn)有pIgR的存在。幾十年來人們普遍認為在小腸,只有柱狀吸收細胞可以合成pIgR、介導(dǎo)IgA轉(zhuǎn)運并分泌sIgA。然而,有研究表明:在大鼠小腸組織中,pIgR的免疫組織化學(xué)陽性染色特異性地位于潘氏細胞內(nèi),提示潘氏細胞與pIgR有一定的關(guān)聯(lián)。潘氏細胞是存在于腸隱窩底部的錐形細胞,已經(jīng)證實潘氏細胞有許多功能,如分泌磷脂酶A2、溶

3、菌酶、防御素(defensins)、抗菌肽等,這些物質(zhì)是腸道先天性免疫的重要基礎(chǔ)。近年來的研究表明,潘氏細胞在炎癥性腸道疾病(IBD)的發(fā)生、發(fā)展中也起重要作用。潘氏細胞是否合成pIgR并參與IgA的轉(zhuǎn)運,對于IBD的發(fā)生機制研究及臨床治療手段的改進而言,具有重要的科學(xué)意義。本論文首先采用分子生物學(xué)的方法,轉(zhuǎn)錄合成了特異性針對大鼠與人pIgR的分子探針;然后采用熒光雙標(biāo)記原位雜交和熒光雙標(biāo)記免疫組織化學(xué)的方法,結(jié)合潘氏細胞的特異性蛋白標(biāo)

4、志物-溶菌酶,檢測了大鼠和人小腸組織中pIgR的mRNA和蛋白的表達情況。實驗結(jié)果顯示:大鼠與人潘氏細胞內(nèi)均可以檢測到pIgR的mRNA和蛋白質(zhì),提示潘氏細胞可以合成pIgR。本論文又采用熒光雙標(biāo)記免疫組織化學(xué)和免疫膠體金電鏡的方法,檢測了潘氏細胞與小腸IgA分布之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn):潘氏細胞的分泌顆粒和細胞基底膜上均含有大量的IgA,提示潘氏細胞所合成的pIgR可能參與IgA的轉(zhuǎn)運。在大鼠小腸中,只有潘氏細胞內(nèi)能夠合成pIgR,而在人

5、小腸中潘氏細胞和腸腺吸收細胞均可以合成pIgR,這表明大鼠與人小腸IgA的轉(zhuǎn)運途徑可能不一致。雖然多聚免疫球蛋白受體(pIgR)在粘膜免疫中起著至關(guān)重要的作用,但有報道指出該蛋白在體內(nèi)的功能具有多面性。研究表明某些上皮腫瘤組織和細胞中pIgR的表達量高于正常組織或細胞,提示pIgR過表達可能與上皮來源腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有一定的相關(guān)性。但是迄今為止,pIgR能否成為腫瘤的Marker或者成為腫瘤治療的分子靶點目前尚未見報道。發(fā)現(xiàn)及闡明pIg

6、R在腫瘤發(fā)生及發(fā)展中的重要作用,將對腫瘤這一人類尚未克服的疑難病癥的診斷及治療具有深遠的意義。本論文首先利用真核轉(zhuǎn)染技術(shù),成功構(gòu)建了人pIgR穩(wěn)定高表達的MDCK細胞株,然后對細胞的特性進行觀察與比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn):與對照組相比,pIgR過表達的MDCK細胞生長速度明顯加快,細胞形態(tài)發(fā)生顯著改變,細胞容易被胰酶消化提示粘附力降低。本論文利用SRB法、PI染色法、western blotting方法以及平皿克隆生長實驗方法對有關(guān)細胞增殖的特征

7、性指標(biāo)進行了檢測。結(jié)果顯示:人pIgR過表達可以使MDCK細胞的增殖能力顯著增強,細胞周期進程加快,細胞增殖指數(shù)明顯升高,PCNA表達量增高,ERK1/2磷酸化顯著增強,而且單個細胞生長能力增強。在上皮細胞形態(tài)變化和細胞與基質(zhì)的粘附力下降的發(fā)生機制中,上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)往往起著至關(guān)重要的作用。EMT的主要特征有細胞粘附分子(如E-鈣粘素)表達的減少、細胞骨架發(fā)生變化、形態(tài)上具有間充質(zhì)細胞的特征等。這種轉(zhuǎn)換允許上皮細胞擺脫細胞

8、-細胞間連接,而表現(xiàn)得更具侵襲性。本論文又利用熒光免疫細胞化學(xué)染色法、transwell小室法對EMT相關(guān)的指標(biāo)進行了檢測。結(jié)果顯示:人pIgR過表達的MDCK細胞形態(tài)上具有間充質(zhì)細胞的特征,細胞骨架發(fā)生改變,具有粘附力下降、遷移和侵襲能力增強等EMT細胞行為學(xué)特征,并且有E鈣粘素減少這一典型EMT分子特征。軟瓊脂克隆形成實驗進一步表明:人pIgR過表達的MDCK細胞具備了一定的體外成瘤能力。上述結(jié)果表明,糖蛋白pIgR高表達具有明顯的