兩種血紅素蛋白的輔因子修飾及其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究.pdf

1、工業(yè)生物催化是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的核心技術(shù)，被認(rèn)為是繼醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)后生物技術(shù)的第三次浪潮，其核心是高效生物催化劑的開發(fā)和生化反應(yīng)過程的分子水平控制。酶作為一種高效生物催化劑，在常溫常壓和中性pH條件下，能夠催化許多化學(xué)方法難以完成的反應(yīng)。而且酶催化效率高、專一性強(qiáng)、可減少或避免副反應(yīng)、符合綠色化學(xué)的要求。但是，由于酶對(duì)熱、酸、堿、氧化劑、有機(jī)溶劑和重金屬離子的穩(wěn)定性差，同時(shí)酶在有機(jī)介質(zhì)中的反應(yīng)效率比在水相中低幾個(gè)數(shù)量級(jí)，這些缺陷大大限制了酶的

2、工業(yè)化應(yīng)用。鑒于此，為了開發(fā)新型、高效的生物催化劑，作者在查閱并分析了大量國內(nèi)外文獻(xiàn)資料及發(fā)展動(dòng)態(tài)的基礎(chǔ)上，確立了以結(jié)構(gòu)和性質(zhì)研究的較為透徹的兩種血紅素蛋白(辣根過氧化物酶、肌紅蛋白)為研究對(duì)象，以改善其穩(wěn)定性和催化功能為研究目標(biāo)，采用輔因子修飾法對(duì)兩種蛋白進(jìn)行了分子水平的改造，從動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)等多個(gè)方面研究了其穩(wěn)定性和催化性能的改變，并通過波譜的方法對(duì)其催化特性得以改善的機(jī)制進(jìn)行深入研究，取得了較為滿意的結(jié)果。論文主要內(nèi)容如下：

3、 (1)設(shè)計(jì)和合成了兩個(gè)人造輔因子HeminD1和HeminD2，即分別在天然輔基血紅素heme的每個(gè)丙酸基側(cè)鏈的末端引入一個(gè)苯環(huán)和一個(gè)羧基或一個(gè)苯環(huán)和兩個(gè)羧基；并通過電噴霧質(zhì)譜和紫外-可見吸收光譜對(duì)其進(jìn)行表征。 (2)分別把HeminD1和HeminD2與脫輔基辣根過氧化物酶重組，成功獲得兩個(gè)新穎的重組酶rHRP1和rHRP2?；钚栽囼?yàn)表明，輔因子修飾提高了辣根過氧化物酶的熱穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑忍耐性。通過紫外．可見吸收光譜、圓二色光

4、譜、熒光光譜和酶活性四種手段，測定了天然和重組辣根過氧化物酶的熱力學(xué)參數(shù)，天然辣根過氧化物酶的解鏈溫度為70.0℃，輔因子修飾后rHRP1的解鏈溫度提高到75.4 ℃，而rHRP2的解鏈溫度提高到76.5℃。動(dòng)力學(xué)研究表明，輔因子修飾后辣根過氧化物酶在水溶液中和在一些有機(jī)介質(zhì)中對(duì)酚類底物的親和性和催化效率有所提高。這些催化行為的改變可能與活性位點(diǎn)的疏水性、活性位點(diǎn)的擴(kuò)大及靜電排斥等幾個(gè)因素有關(guān)。圓二色及熒光光譜研究表明，輔因子修飾改變了

5、辣根過氧化物酶血紅素和色氨酸的微環(huán)境，提高了α-螺旋含量和芳香族氨基酸殘基周圍三級(jí)結(jié)構(gòu)的含量。輔因子修飾后辣根過氧化物酶性質(zhì)上的一些改善可能是由它構(gòu)象上的變化引起的。對(duì)照組實(shí)驗(yàn)表明，本文所用的重組條件不會(huì)改變辣根過氧化物酶的構(gòu)象和性質(zhì)。 (3)通過輔因子修飾法對(duì)肌紅蛋白進(jìn)行分子水平的改造，得到兩個(gè)新穎的重組蛋白rMb-HeminD1和rMb-HeminD2。動(dòng)力學(xué)研究表明，輔因子修飾的肌紅蛋白(rMb-HeminD1)在水溶液