VEGFR胞外結合域（KDR3）基因的克隆表達及功能研究.pdf

1、腫瘤的生長和轉移依賴于血管的生成，抗血管生成療法是一個正在興起的腫瘤生物治療的新途徑。血管內皮細胞生長因子(VEGF)是最主要的調節(jié)因子，通過與受體的相互作用刺激血管內皮細胞增殖，促進腫瘤的增長和轉移。由于人VEGFRII(KDR)編碼1354個氨基酸，對其進行表達和功能研究存在一定難度，因而選取其主要功能部位進行研究。已有的實驗提示在其7個免疫球蛋白區(qū)域中區(qū)域3對于VEGF的結合貢獻最突出。 本實驗經查閱參考文獻及利用計算機分

2、子模擬系統(tǒng)對KDR3與VEGF的結合的關鍵位點進行了分析，設計并構建了三個KDR3突變體：M1、M2、M3。首先，從人臍靜脈內皮細胞中提取總RNA，利用RT-PCR方法克隆了人KDR3成熟肽的cDNA序列，利用重疊延伸PCR方法獲得了各突變體的DNA片段。然后，將它們分別插入pET-His載體中，構建重組質粒，利用E．coliBL21進行了表達，結果表明相應工程菌目的蛋白在大腸桿菌中的表達產物以包涵體形式存在，包涵體經洗滌后以Sepha

3、cryl-200凝膠柱層析進行純化，純化蛋白在還原型和氧化型谷胱甘肽組成的氧化還原體系中進行復性，獲得了純度達90％以上野生型及突變體KDR3的蛋白純品，為可溶性受體治療腫瘤打下基礎。 最后，構建誘餌蛋白載體PAS2-1一KDR3及目的蛋白載體PACT-2-VEGF，并分別轉化至酵母菌株Y190中，對KDR3及VEGF分析，結果表明二者均不具有轉錄激活活性。在酵母系統(tǒng)中驗證KDR3和VEGF的相互作用，結果未能檢測到兩者的相互作